潜在土壤胞外酶活性的高通量荧光测量

酶测定可以用来量化潜在EEAS以及类似的样品中比较活动。在这里，我们提出代表结果的比较有经验的环境气候条件（ACN）到暴露于高浓度CO 2和加热处理（EHN）（ 图2-6）土壤的土壤实验气候研究。在所有地块植被是由C4草Bouteloua股薄肌 （HBK）为主导的北部混合草草原的特征滞后。和两个C3草本植物，Hesperostipa comata TRIN和落叶松。和Pascopyrum史密斯 （Rydb.），约20％的植物是由莎草和杂类的。关于网站的介绍和现场实验设计的更多信息可以在参考文献28-30被发现。土壤是从内各使用1.5厘米直径的核心，以评估应对气候改变土壤Ç的EEAS处理区两个不同深度（0-5厘米和5-15厘米）收集onditions。在我们的例子中（ 即 图2-6），样本大小为（N = 3）。不管这个最小样本量，变化相对较小，在大多数情况下（就证明了误差线），并反映强劲处理区之间的变异潜力EEAS。方差（ANOVA）和Tukey事后多重比较分析被用来确定处理区和土层之间的酶活性显著的变化。 以下代表性成果已提供给演示如何高通量，荧光法可用于土壤测试（1）整体欧洲经济区，（2）如何EEA化学计量可以表明生态系统级进程和（3）的关系之间的孵化温度和欧洲经济区。土壤EEA的通常是研究，涉及微生物的功能转移到土壤养分循环;有用的指标，以评估应对气候变化，植物群落s微生物的营养需求hifts，以及更广泛生态系统功能31-33。 EEA化学计量最近已被采纳为指标由相交的生态化学计量理论和生态学代谢理论来评估相应的环境条件5的潜在微生物的营养失衡评估土壤生化养分循环。许多研究表明，广泛的化学计量比是反映营养生长的限制34-36;和土壤养分变得有限，微生物反应通过分配资源代谢产生特异性的酶，收购缺乏的营养物质37。 Ecoenzymatic C：N：P化 ​​学计量比因此可用于识别响应各种环境扰动的潜在微生物群落的养分需求相对变化5。最后，EEAS的温度敏感性可能是有用的，以评估如何土壤微生物群落功能多样性的原因可能是温度变化的影响<燮> 7,38。酶的温度敏感性可以土之间有很大的变化为一个单一的酵素类，并产生酶的微生物群落表现出转移酶活性的历史条件下7对应于气候变化。因此，涉及到电子工程师的热生态学酶活性的问题可以评估微生物功能动态和地下生态系统过程在应对气候变化39,40一种有用的方法。 在这个例子中，电位C-，N-，并测定在0-5厘米土壤深度的P-酶的收购活动并没有被实验性治疗（ 图2a）不同。然而，在5-15厘米土层，一些潜在的EEAS没有显著差异（ 图2b）。例如，在C-降解酶的β-1，4 -葡萄糖苷酶和β-D-纤维二糖水解为低的EHN曲线（P≤0.038; 图2b）相比，ACN地块。在N和P矿工alizing酶（β-1 ,4-N-乙酰氨基和磷酸酶，分别）也较低在EHN曲线（P≤0.012; 图2b）相比，ACN 5-15厘米土壤深度。 计算和绘图的总和所有的C-N-或P-循环潜在EEAS可以观察到有关的潜在土壤C-，N-和/或P-周期（ 图3）更广泛的模式的有用的方法。在这个例子中，β-1，4 – 糖苷酶，β-D-纤维二糖水解，β-木糖苷酶和α-1，4 – 葡萄糖苷酶的潜在EEAS的总和被计算为表示潜在的碳循环活动。 β-1 ,4-N-乙酰氨基和L-亮氨酸氨肽酶的总和计算为代表潜在的N骑自行车活动。磷酸酶被用来代表潜在的磷循环活动。在这个例子中，总的C-，N和P循环的潜在EEAS在EHN地块相比，ACN地块在5-15厘米土层（FIGU走低再3）。然而，这种趋势是只为总氮和磷循环活动显著（P≤0.046， 图3）。土壤EEAS没有显著的治疗地块之间在0-5厘米土层差异（ 图3）。在这个例子中，研究结果表明在对土壤深度相反的趋势在酶的活性官能团（ 即 C-，N-，或P-降解酶）的处理区中（ACN与EHN）。例如，C-，N-和在周围小区（ACN）P降解土壤EEAS走高在较低的深度相比，暴露于高浓度CO 2和加热（EHN），它展示了一个逆图案（ 图3A-C中的土壤）。 酶的化学计量是评估环境（ 图4）潜在酶活性的另一个有用的方法。对营养物质的微生物需求受微生物生物量的元素化学计量有关环境决定养分有效性32。同样，微生物产生特定的酶（ 即 C-，N-或P-降解酶），以满足他们的土壤环境中的营养需求，也被称为生态化学计量41。潜在EEAS的比率来评估微生物营养需求的一种方法。例如，以1:1的比例两者之间酶的官能团（例如，在C：N养分收购）会建议考虑微生物生物量碳时，对于N的需求相对高，对C的需求：N比在社区层面一般是8:1 42。在这个例子中，土壤酶的化学计量C：N，C：P或N：P活动显著治疗地块之间在0-5 cm土层深处（ 图4a-c）的差异。然而，潜在的酶C：P和N：P比值在EHN较高地块相比，ACN地块在5-15厘米土壤深度（P = 0.05; 图4b和4c）。这一观察表明，有相对较高的P矿化EEAS相比，C和N的欧洲经济区乙腈地块（相对于EHN）在5-15厘米土层。酶C：N并购活动比表现出了相似的趋势，即由全碳EEAS具有较高的C表明：不适用由于较高的电位C EEAS在乙腈地块在较低的深度相比，EHN（ 图4a）。 温度可影响土壤EEAS。然而，在典型的实验室试验中，土壤酶是在可能不原位温条件对应于一个单一的温度测量。我们的荧光酶测定方法允许我们通过合并多个实验室的孵化温度进行比较原位温度的影响考虑。使用实验室孵化在多个温度允许我们使用Arrhenius图和Q 10的计算分析温度依赖性酶动力学数据。 Arrhenius图是用于可视化活化能;和绘制我们ING酶活性的对数（y轴因变量）作为转换为开氏度（1 / K）上的x轴的反温度的函数（ 也就是独立变量; 图5a-c）所示 。活化能通常被定义为催化的化学反应（ 即降低给定的基片成较小的产品）所需的最小能量。对于我们的目的，活化能可作为酶催化反应的温度敏感性的代理。较高的活化能表明酶的温度敏感性。同样，活化能（ 即 图5D-F）直接对应于Q 10值（ 即 图6a-c）所示 。用于计算活化能和实际应用公式的进一步的解释，可在许多过去找到工作40,43-45。 Arrhenius图，活化能，和Q 10地块提供冗余信息，不应该所有被使用的相同的手稿提交数据发布（ 图5和6）。因此，在使用这些技术时，有必要选择最合适的情节类型，您酶的温度-动力学数据10。所有的情节类型（阿累尼乌斯和Q 10）已提交这里用于演示目的，以提供如何呈现酶结果可视化的例子。 在我们的例子中，我们评估了潜在的酶动力学电位C型，N型和P-EEAS两个治疗地块在两个土层中（ 图5，图6）。这一发现表明，EEAS的温度灵敏度是不处理区在任土壤深度的活化能为展示在Arrhenius图（ 图5a-c）和相应的活化能（ 图DF）和（不奇怪）对于Q之间显著不同10巴解组织TS（在15°C和25°C孵育实验室之间的这个例子中， 图6a-C）。这表明，酶动力学不是由字段的实验处理在这项研究的影响。 表1中。荧光标准浓度深孔板的设计与土壤样品。模板组织和装载荧光标准（MUB或MUC）与土壤样品进深孔板孵育前。注：列代表相同的土壤样品（800微升土壤泥浆添置）。荧光标准浓度的梯度加载的每一行（200微升添加）。每个单元代表荧光标准浓度以及土壤泥浆增加。例如，S1 – S12代表土壤样品（800微升土浆）; MUB 0-100微米= 4-Methylumbelliferone浓度（200μl的添加）。在这个例子中，H行是开放的，并且因此是可用的，如果需要，包括更高的荧光标准浓度。这个决定增加标准曲线的浓度可能是必要的高电位酶活性（和/或所用的底物浓度）为特定的土壤样品。为您的样品的潜在酶活性应属于标准曲线值的范围之内。 点击这里查看更大的表 。 表2。深孔板设计土壤样品与底物。模板组织和加载土壤样品和基质进深孔板前孵化。注：列代表相同的土壤样品（800微升，使金正日浆添加）。不同衬底跨越每行加载（200微升添加）。每个单元代表土壤样品加底物加法。例如，S1 – S12代表独特的土壤样品（800微升土浆）。底物（200微升添加）包括：BG = 4 – 甲基伞形酮酰-β-D-吡喃葡萄糖苷; CB = 4 – 甲基伞形酮-β-D-纤维二糖苷; NAG = 4 – 甲基伞形酮的N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷; PHOS = 4 – 甲基伞形酮酰磷酸盐：XYL = 4 – 甲基伞形酮酰-β-D-吡喃木糖苷，AG = 4 – 甲基伞形酮的α-D-吡喃葡萄糖苷;和LAP = L-亮氨酸-7-酰氨基-4 – 甲基香豆素盐酸盐。在这个例子中，排H是开放的，因此是可以包含另一个基板如果需要评估的另一个潜在的酶的活性。 点击这里查看更大的表 。 温度 时间 4℃ 〜23小时 15°C 6小时 25°C 3小时 35°C 1.5小时 表3。培养箱的温度所需的相应的温育时间段。孵育的温度和用于酶测定过程相对应的时间段。 表4。 MUB和MUC标准曲线计算。演示如何组织 ）MUB 和 b）MUC原始荧光数据（微摩尔），随后计算斜率，截距，和R平方值。为了计算斜率，截距，和R平方值从标准浓度曲线，选择（或曲线）的MUB和/或MUC原始荧光数据作为因变量（Y轴）和标准浓度（微摩尔）为自变量（x轴）。注：MUB = 4 -甲基伞形酮; MUC = 7 -氨基-4 -甲基香豆素点击这里查看大桌子 。 表5。 。酶的活性计算示范如何一 ）组织样品的原始荧光数据，然后执行所需的（BF）来计算EEAS到步骤：微摩尔活动/ g干土/小时。注：S1 – S12代表独特的土壤样品。底物包括：BG = 4 – 甲基伞形酮酰-β-D-吡喃葡萄糖苷; CB = 4 – 甲基伞形酮-β-D-纤维二糖苷; NAG = 4 – 甲基伞形酮的N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷; PHOS = 4 – 甲基伞形酮酰坡sphate：XYL = 4 -甲基伞形酮-β-D-吡喃木糖苷; AG = 4 -甲基α-D-吡喃葡萄糖苷，以及LAP = L-亮氨酸-7-氨基-4 -甲基香豆素盐酸盐。 点击这里查看更大的表 。 图1。与原始荧光数据作为因变量（Y轴）和标准浓度（微摩尔）为自变量（X轴），标准曲线的MUB标准曲线图。散点图可视化。 图2。碳，氮，磷循环酶活性 。在草原和暖气CO 2浓度升高恩潜在EEAS富集（PHACE）现场控制图（ACN：暴露在环境气候条件下）和处理区（EHN：暴露在温度升高和高CO 2）。土壤酶测定在 ）0-5厘米土层和 b）5-15厘米土层。竖线代表平均值±SE注：乙腈=环境-气候地块; EHN = CO 2浓度升高和加热曲线。 点击这里查看大图 。 图3。总碳，氮，磷循环酶的化学计量比参与收购的）C，B）不适用潜在EEAS的总和， 和 c）的P-在PHACE实验两个治疗组在0-5厘米和5 – 15厘米土壤深处。 Vertical棒代表平均值±SE注：乙腈=环境-气候地块; EHN = CO 2浓度升高和加热曲线。 点击这里查看大图 。 图4。酶的化学计量总碳，氮和磷循环酶的活性酶收购活动化学计量比在大草原暖气和高架的CO 2浓度增高（PHACE）现场控制的阴谋。（ACN：暴露到环境气候条件下）和处理区（EHN：暴露在温度升高而升高的CO 2）。土壤总一）C：N，B）C：P和C）N：P在0-5厘米和5-15厘米土层绘制两个治疗组。竖线代表平均值±SE注：乙腈=环境-气候地块; EHN = CO 2浓度升高和加热曲线。 点击这里查看大图 。 图5。显示潜在EEAS的总碳，氮，磷循环酶活化能温度敏感性使用Arrhenius图总一）C，B）N和C）P降解酶;以及为合计D对应的活化能值）C ，E）N，和 f）P有辱人格的待遇地块和土壤深度之间酶在大草原暖气和升高的CO 2浓度增高（PHACE）网站。为活化能（ 即 DF）竖线代表平均值±SE注：乙腈=一mbient -气候地块; EHN = CO 2浓度升高和加热曲线。出版，值得注意的是，笔者通常会选择要么呈现Arrhenius图（ 即 AC）或活化能量值（ 即 DF），但不能同时绘图类型是很重要的。 点击这里查看大图 。 图6。总碳，氮，磷循环辅酶Q10（15-25℃），温度测量灵敏度为Q 10的潜在EEAS，基于实验室的孵化在15°C和25°C为总一）C，B）不适用的，并C）P降解酶处理区和土壤深度之间的草原和暖气CO 2浓度升高</ sub>的富集（PHACE）网站。为Q10的竖线代表平均值±SE注：乙腈=环境-气候地块; EHN = CO 2浓度升高和加热曲线。 点击这里查看大图 。