שימוש pHluorin כדי להעריך את הדינמיקה של קולטני הדרכה אקסון בתרבות התא בעובר אפרוח
Summary
אנו מתארים כאן את השימוש בגרסת חלבון פלואורסצנטי ירוק רגיש pH, pHluorin, כדי לחקור את הדינמיקה המרחבית-זמנית של קולטני הדרכה אקסון סחר על פני התא. הקולטן pHluorin מתויג מתבטא הן בתרבות התא in vivo, באמצעות electroporation של העובר אפרוח.
Abstract
במהלך הפיתוח, קולטני הדרכה אקסון לשחק תפקיד מכריע בוויסות רגישות אקסונים רמזים אטרקטיביים ודוחה כאחד. ואכן, הפעלת קולטני ההנחיה היא הצעד הראשון של מנגנוני האיתות המאפשרים לאקסון טיפים, קונוסים לצמיחה, להגיב לליגנדים. ככזה, אפנון הזמינות שלהם על פני התא הוא אחד המנגנונים המשתתפים בקביעת רגישות חרוט הצמיחה. אנו מתארים כאן שיטה כדי לדמיין במדויק את הדינמיקה פני השטח של תא spatio-temporal של קולטן הדרכה אקסון הן במבחנה de vivo בחוט השדרה אפרוח המתפתח. ניצלנו את מאפיין הפלואורסצנטיות תלוי ה- pH של וריאנט חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כדי לזהות באופן ספציפי את השבר של קולטן ההנחיה של האקסון הממוען לקרום הפלזמה. אנו מתארים לראשונה את אימות במבחנה של מבנים תלויי pH כאלה ואנו מפרטים עוד יותר את השימוש בהם ב- vivo, באקורד עמוד השדרה של הגוזל, כדי להעריך את הדינמיקה המרחבית-טמפורלית של קולטן ההדרכה של האקסון.
Introduction
במהלך הניווט שלהם, אקסונים משלבים רמזים סביבתיים מרובים המנחים אותם לעבר המטרה שלהם. רמזים אלה להפעיל קולטני הדרכה על פני השטח של מסופי אקסון, קונוסים הצמיחה, אשר בתורו ליזום מסלול איתות מתאים. לכן, הרגולציה הזמנית והמרחבית של התפלגות פני התא של הקולטנים היא קריטית כדי להגדיר את הרגישות של חרוט הצמיחה1. בהקשר זה, חציית קו האמצע על ידי אקסונים קומיסרים היא מודל מצוין לחקור את הרגולציה של רמות פני התא הקולטן. בחוט השדרה המתפתח, אקסונים קומיסרים נמשכים בתחילה לכיוון צלחת הרצפה הגחונית שבה הם חוצים את קו האמצע. לאחר חציית הגבול, הם מאבדים את ההיענות שלהם למשיכת צלחת הרצפה ולקבל תגובה דוחי צלחת הרצפה, כך שהם יכולים לצאת צלחת הרצפה לנווט לכיוון היעד הסופי שלהם בצד הנגדי של מערכת העצבים2,3. ויסות זמינות הקולטן על משטח חרוט הצמיחה הוא אחד המנגנונים שבבסיס המתג של היענות רמזים קו האמצע4,5. לכן, ניטור סלקטיבי של הקולטנים נוכח קרום הפלזמה של קונוסים צמיחה הוא בעל חשיבות עליונה. אנו מתארים כאן שיטה המבוססת על מאפיין פלואורסצנטי תלוי pH של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) גרסה כדי לדמיין באופן ספציפי את קולטני הדרכה אקסון הממוענים קרום פלזמה במבחנה in vivo, בחוט השדרה אפרוח המתפתח.
רוטמן ועמיתיו מהונדסים על ידי מוטציות נקודתיות גרסאות רגישות pH של GFP כולל pHluorin האקליפטי6. pHluorin האקליפטי יש את המאפיין של להיות nonfluorescent כאשר נחשף pH חומצי (<6), תוך היותו פלואורסצנטי ב- pH ניטרלי. זה מאפשר להבחין קולטנים שאינם פלואורסצנטיים מקומיים בתאים חומציים תאיים(כלומר אנדוזומים, סחר בשלפוחיות) מקולטנים פלואורסצנטיים המשולבים בקרום הפלזמה ובכך נחשפים ל- pH ניטרלי חוץ-תאי7. ניצלנו זאת כדי לנטר את לוקליזציית קרום הפלזמה של plexinA1, קולטן הדרכה אקסון המתווך את תגובת חרוט הצמיחה לסמפורין דוחה קו האמצע 3B5 (איור 1A). אנו מתארים כאן אפיון במבחנה של מבנה pHluorin-plexinA1, יחד עם ב- ovo electroporation8-10 של מבנה זה בחוט השדרה אפרוח המתפתח ואחריו ניתוח מיקרוסקופי של cryosections המאפשרים לעקוב אחר הדינמיקה קולטן הדרכה אקסון ב vivo עם רזולוציות מרחביות וטמפורליות כאחד.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מספק הליך שלב אחר שלב כדי לעקוב אחר הדינמיקה של קולטן הדרכה אקסון הן בתרבות התא והן בהקשר ההתפתחותי של חוט השדרה עובר אפרוח.
כדי לעצב חלבון מתויג דה נובו pHluorin, שתי נקודות צריך להילקח בחשבון לגבי אסטרטגיית השיבוט. ראשית, תג pHluorin צריך להיחשף לומן של אנדוזומים ח…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים להומאירה נוואבי, פרדריק מורט ואיזבל סניאס על עזרתם. עבודה זו נתמכת על ידי CNRS, האגודה פרנסיס contre les מיופתיות (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA כדי V.C.; C.D-B ו- A.J נתמכים על ידי מלגות לה ליגה קונטרה לה סרטן Labex DevWeCan, בהתאמה.
Materials
| COS7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| DMEM GlutaMAX | GIBCO | 61965-026 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360-039 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO | 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Exgen500 reagent | Euromedex Fermentas | ET0250 | |
| PBS -Ca2+ -Mg2+ | GIBCO | 14190-094 | |
| Fast green dye | Sigma | F7252 | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy | 15714-S | Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7041 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Cryomount | Histolab | 00890 | |
| Hoechst 34580 | Invitrogen | H21486 | |
| Mowiol 4-88 | Fluka | 81381 | |
| Consumables | |||
| Bottom-glass 35 mm dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 5 ml Syringe | Terumo | SS-05S | |
| Needles 0.9 mm x 25 mm | Terumo | NN-2025R | |
| Capillaries | CML | PP230PO | capillaries are stretched manually in the flame |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS | |
| Material | |||
| Curved scissors | FST | 129-10 | |
| Microscalpel | FST | 10316-14 | |
| Forceps | FST | Dumont #5 REF#11254 | |
| Equipment/software | |||
| Time lapse microscope | Zeiss | Observer 1 | |
| Temp module S | PECON for Zeiss | ||
| CO2 module S | PECON for Zeiss | ||
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Eggs incubator | Sanyo | MIR154 | |
| Electroporator apparatus | Nepa Gene CO., LTD | CUY21 | |
| Electrodes | Nepa Gene CO., LTD | CUY611P7-4 | 4 mm platinum electrodes |
| Fluorescence stereomicroscope | LEICA | MZ10F | |
| Cryostat | MICROM | HM550 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000, X81 | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| CLC Main Workbench software | CLC Bio | ||
References
- Winckler, B., Mellman, I. Trafficking guidance receptors. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Jacob, T. C., et al. . J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
- Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. J. Comm function in commissural axon guidance: cell-autonomous sorting of Robo in vivo. Nat. Neurosci. 8, 156-163 (2005).
- Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Miesenbock, G. Synapto-pHluorins: genetically encoded reporters of synaptic transmission. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 213-217 (2012).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), 1792-17 (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), (2007).
- Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. In ovo electroporation of miRNA-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by DiI injection in open-book preparations. J. Vis. Exp. (68), (2012).
- Rohm, B., Ottemeyer, A., Lohrum, M., Puschel, A. W. Plexin/neuropilin complexes mediate repulsion by the axonal guidance signal semaphorin 3A. Mech. Dev. 93, 95-104 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J. Vis. Exp. (8), (2007).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and actin control polarized expression of TI-VAMP vesicles to neuronal growth cones and their fusion with the plasma membrane. Mol. Biol. Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Perret, E., Lakkaraju, A., Deborde, S., Schreiner, R., Rodriguez-Boulan, E. Evolving endosomes: how many varieties and why. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 423-434 (2005).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J. Vis. Exp. (69), (2012).
- Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66, 370-377 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), 3024-30 (2011).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
- Holzhausen, L. C., Lewis, A. A., Cheong, K. K., Brockerhoff, S. E. Differential role for synaptojanin 1 in rod and cone photoreceptors. J. Comp. Neurol. 517, 633-644 (2009).
- Shang, Y., Claridge-Chang, A., Sjulson, L., Pypaert, M., Miesenbock, G. Excitatory local circuits and their implications for olfactory processing in the fly antennal lobe. Cell. 128, 601-612 (2007).
- Dittman, J. S., Kaplan, J. M. Factors regulating the abundance and localization of synaptobrevin in the plasma membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11399-11404 (2006).
- Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P., Wachowiak, M. In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse. Neuron. 42, 9-21 (2004).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).
- Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development. CSH Protoc.. 2008, (2008).
- Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. J. Vis. Exp. (60), (2012).
- Hanson, G. T., et al. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application. Biochimie. 41, 15477-15488 (2002).
- Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses. Neuron. 77, 1109-1121 (2013).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).
- de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
