Контекстная и подают реплики Страх принадлежности Тест Использование видео параметры системы у мышей
Summary
Данная статья представляет собой протокол для контекстной и подают реплики страха теста кондиционирования с использованием системы видео для анализа и оценки страх обучения и памяти у мышей.
Abstract
Тест контекстная и подают реплики страх кондиционирования является одним из поведенческих тестов, что оценивает способность мышей к обучению и запомнить ассоциацию между сигналами окружающей среды и отвращение опыта. В этом тесте мышей помещают в испытательной камере и даны обрезки условного раздражителя (слуховые CUE) и отталкивающее безусловного раздражителя (электрический Footshock). Через некоторое время задержки, мыши подвергаются той же камере кондиционирования и различной формы камеры с презентации слуховой кия. Замораживание поведение во время испытания измеряют как показатель страха памяти. Для анализа поведения автоматически, мы разработали систему анализирующей видео с помощью программы прикладного программного обеспечения ImageFZ, который доступен для бесплатной загрузки на http://www.mouse-phenotype.org/. Здесь, чтобы показать детали нашего протокола, мы демонстрируем нашу процедуру контекстной и подают реплики тест кондиционирования страх у мышей C57BL/6J помощью ImageFZ систэм. Кроме того, мы проверили наш протокол и производительность системы видео анализ, сравнивая замерзания время, измеренное системой ImageFZ или измерительной системы компьютера photobeam основе с тем, что забил человека-наблюдателя. Как показано в наших представительных результатов, полученные ImageFZ данные были аналогичны тем, анализировали с помощью человека-наблюдателя, указывая, что поведенческий анализ с использованием системы ImageFZ обладает высокой надежностью. Настоящий фильм статье приводится подробная информация о процедурах тестирования и будет способствовать пониманию экспериментальной ситуации.
Introduction
Тест контекстная и подают реплики страх кондиционирования является поведенческая парадигма используется для оценки ассоциативный страх обучения и памяти у грызунов 1-3. Этот тест широко используется, чтобы понять нейробиологические механизмы страха обучения и памяти в трансгенных и мышей с 1,4-16. Замораживание поведение, которое определяется как полной неподвижности, за исключением дыхания, является общим ответом на страшных ситуациях. В этом поведенческой парадигмы, после животные подвергаются спаривания слуховой кия с электрическим Footshock, они реагируют на страх производящих стимула, отображая Замирание, которая измеряется как показатель ассоциативного обучения страха и памяти. Этот тест требует меньше сложную технику, меньше физических нагрузок следователем и гораздо меньше времени обучения для мышей по сравнению с другими обучения и памяти задач, это как правило, требует примерно 5-10 мин / день на мышь в течение 2 дней. Хотя процедура тестирования сиmple и требует мало времени для выполнения, исследователь должен внимательно наблюдать и измерять поведение мыши, поэтому несколько автоматизированные измерительные системы были разработаны для проведения поведенческого анализа 17-20. Наша система видео-анализ, который мы разработали с программой ImageFZ программного обеспечения, позволяет легко анализировать поведение замерзания и производят очень надежные результаты. Эта статья содержит подробную информацию на нашем процедуры тестирования и описывает, как использовать программу ImageFZ программного обеспечения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Тест контекстная и подают реплики страх кондиционирования является одним из наиболее широко используемых парадигм для оценки обучения и памяти. Этот тест является одной из форм павловской кондиционирования, в котором ассоциация между контексте и / или условного раздражителя (слуховые CUE) и отвращение раздражитель (электрический Footshock). После даже одного спаривания в контекстном / слуховой кия и Footshock, мыши обнаруживают длительное замораживание, когда сталкиваются с обеих контексте или кия. В этом тесте поведение замораживание используется в качестве индекса страха памяти. Фармакологические и поражения исследования показали, что формирование памяти, консолидация и извлечения регулируется несколькими областях мозга, таких как миндалина, гиппокамп, и префронтальной коре 3,33-35. Кроме того, молекулярная генетика исследования продемонстрировали роль определенных генов и молекул, участвующих в процессах обучения и памяти в этих регионах головного мозга с использованием генной инженерии мышей 36. Таким образом, этот тест Simplе и полезным для изучения нейробиологические основы основной обучение страх и память. В этом фильме статье мы представили наш протокол для обеспечения экспериментаторов с подробной информацией, чтобы понять и легко выполнить тест.
Замирание количественно путем прямого наблюдения человеческими экспериментаторов. Хорошо обученный экспериментатор будет производить надежные, стабильные результаты по наблюдениям. Тем не менее, этот метод предполагает потенциальные проблемы, такие, как различия в метода наблюдений, предубеждений наблюдателей, и простых количественного ошибок, что делает его трудно напрямую сравнить результаты от независимых экспериментаторов и разных лабораториях. Автоматизированная система измерения компьютер photobeam основе также используется 26,30-32. Тем не менее, эта система также представляет потенциальные проблемы в измерении поведения замораживания. Из-за сенсорного устройства, эта система может быть не в состоянии обнаружить небольшие движения головы, что бы TypicaLLY забито как "активный" через человеческого наблюдения. Кроме того, дрожа при замораживании может рассматриваться в качестве незамерзающих потому что, когда зависает животных, периодически перерывы в photobeam наблюдаются как следствие трепетом. В качестве альтернативного способа, автоматизированные изображение-и видео-анализаторы были разработаны 17-20,37,38. Anagnostaras др.. 37 описано несколько систем с программного обеспечения для анализа изображений программы, которые имеют хорошую юридическую силу и оценка замораживания хорошо 17,20,37-38. Однако, большинство из этих систем и программ анализа должны быть получены от коммерческих поставщиков и, как правило, дороже. Мы разработали программу ImageFZ программного обеспечения для анализа поведения замерзания, и эта программа распространяется в виде программы свободного программного обеспечения. ImageFZ обнаруживает мышь как орган пикселей (частиц) и дискриминирует тонкие движения мыши, как "замораживание" или "незамерзающей" в зависимости от количестваплощадь неперекрывающихся участках между частицами каждой парой последовательных изображений. Как показано на репрезентативных результатов измерений с помощью программы ImageFZ соответствуют или более точными, чем полученные с использованием других методов. Таким образом, программа ImageFZ автоматически измеряет поведение, что человеческие наблюдатели судить, как замораживание с помощью определенных критериев. Кроме того, программа вычисляет ImageFZ пройденное расстояние (см) до, во время и после воздействия Footshock, что облегчает оценку чувствительности ударной и анализа замерзания поведения.
Существуют методологические различия между лабораториями. Эти различия могут привести к трудности в сравнении данных среди лабораториях и в репликации результатов в разных лабораториях. Для получения более точных и сопоставимых данных, необходимо стандартизировать протокола испытаний как можно больше. Система анализа с ImageFZ приводит к автоматизации процедур испытаний, которые могут внести свой вклад встандартизация протоколов используется во лабораториях.
Несколько поведенческие реакции необходимо учитывать при анализе поведения замерзания. Во-первых, когда животные сталкиваются страшный ситуацию, они могут бежать вместо замораживания 39. Спасаясь является одним из реакции страха, и его появление приведет к недооценке страх память. Во-вторых, замораживание может зависеть от общего уровня активности, и уровень активности в экспериментальных и контрольных мышей необходимо изучить. Например, хотя мыши, лишенные мускариновые рецепторы М1 ацетилхолина показали сниженные уровни замораживания по сравнению с мышами дикого типа, различные поведенческие тесты показали, что результаты могут быть отнесены к их гиперактивности фенотипа вместо их ухудшение памяти 18. ImageFZ вычисляет расстояние (см), пройденное субъектов. Данные доступны для изучения или не существует различия в общих уровней активности между субъектами. Если существует разница группа впройденное расстояние, один из возможных подходов к проблеме заключается в рассмотрении расстояние, пройденное в течение первого 2 мин обучения как базового деятельности и использовать соотношение подавления (коэффициент подавления = (активность во время тестирования) / (активность во время базовой линии + активности в течение тестирование)) в качестве вторичного индекса страха 17,40. Наконец, разница в чувствительности боли, вызывая изменения в реакционной к электрической Footshock, если таковые имеются, может привести к изменениям в поведении замерзания. ImageFZ также вычисляет расстояние (см) подробно от 2 сек до выдержкой 2 сек Footshock до 2 секунд после его выдержки в течение 6 (с), который может быть использован в качестве индекса чувствительности Footshock.
Видео-анализаторы были разработаны для измерения замерзания поведение альбиноса, черный, агути, и разбавить коричневые мышей. ImageFZ используется лоток черный пол и черные сетки для изучения белых мышей (см. рисунок 1В). Черные сетки выполнены из SPECI союзник обработке металлов с покрытием черной краской и имеют электрическую проводимость, аналогичную из непокрытыми металлическими сетками, которые обычно используются для черных мышей. ImageFZ также анализирует Замирание у крыс и других грызунов через настройках параметров программы. В текущей версии ImageFZ, поведение субъекта записывается на видеокамеру от верхней стенки для анализа замерзания. ImageFZ также могут быть использованы в настройке, где изображения захватываются со стороны камеры. Кроме того, ImageFZ контролирует максимум 4 аппаратов. Эта функция позволяет исследователю одновременно изучить 4 мышей, экономя время и снижая потенциальные влияния от различия во времени выполнения каждого субъекта и тестирования того, на поведение. Таким образом, ImageFZ упрощает процедуру тестирования и анализа поведения замерзания, и эта программа облегчает тестирование при меньших затратах труда и без какой-либо подготовки для поведенческих экспериментов.
e_content "> В лаборатории Миякава, мы оценили более 110 штаммов генетически модифицированных мышей и контрольных мышей дикого типа в тесте кондиционирования контекстного и подают реплики страха с использованием системы видео для анализа и выяснения последствий данного гена на обучение и память 41-42 Мы получили большой набор исходных данных для более чем 5000 мышей необработанные данные, которые были использованы для опубликованных научных статей 4-16 включены в 'Мышь фенотипа базы данных »как общественного базы данных (URL:.. Http: / / www.mouse-phenotype.org/). Настоящий фильм статье приводится подробная информация о деталях нашей экспериментальной процедуры и способствует пониманию ситуации тестирования.Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Некоторые из данных, приведенных здесь, были получены в лаборатории доктора Жаклин Н. Кроули в американского Национального института психического здоровья, и мы хотели бы поблагодарить ее за предоставленную нам возможность показать данные в статье. Мы также благодарим Кадзуо Наканиши за помощь в разработке ImageFZ программу для поведенческого анализа. Это исследование было поддержано грантом-в-помощь по научным исследованиям (B) (21300121), Грант-в-помощь по научным исследованиям по инновационным территориям (Комплексная Мозг Наука сети) от Министерства образования, науки, спорта и культуры Японии , грант от Нейроинформатика Японского Центра (NIJC) и грантов от гребня Японии науке и технике агентства (JST).
Materials
| ImageFZ program | Developed by Tsuyoshi Miyakawa | This program is available through O'Hara & Co., Tokyo, Japan and for free download at http://www.mouse-phenotype.org/. This software runs on 32-bit Windows XP/Vista/7. | |
| Conditioning chamber | O'Hara & co., Japan | CL-3002L | For mouse. |
| Cued test chamber | O'Hara & co., Japan | CLT-3002L | For mouse. |
| Interface | O'Hara & co., Japan | CL-1040 | The interface includes a white noise/tone generator, which can be controlled by ImageFZ program. |
| Scrambled shock generator | O'Hara & co., Japan | SGA-2040 | The shock generator can be controlled by ImageFZ program. |
| Shock grid tester (ammeter) | O'Hara & co., Japan | SG-T | |
| USB video capture device | XLR8 | USB2IVOSX | |
| Quad image splitter | Wireless Tsukamoto Co., Ltd., Japan | 400AS | |
| Soundproof room | O'Hara & co., Japan | CL-4210 | |
| Freeze Monitor | San Diego Instruments, Inc., CA, USA | 16 x 16 photbeam array ( 2.5 cm spacing) |
References
- Crawley, J. N. . What’s wrong with my mouse: behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , (2007).
- Fanselow, M. S., Poulos, A. M. The neuroscience of mammalian associative learning. Annu. Rev. Psychol. 56, 207-234 (2005).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu. Rev. Neurosci. 23, 155-184 (2000).
- Nakajima, R., et al. Comprehensive behavioral phenotyping of calpastatin-knockout mice. Mol. Brain. 1, 7 (2008).
- Ikeda, M., et al. Identification of YWHAE, a gene encoding 14-3-3epsilon, as a possible susceptibility gene for schizophrenia. Hum. Mol. Genet. 17, 3212-3222 (2008).
- Sakae, N., et al. Mice lacking the schizophrenia-associated protein FEZ1 manifest hyperactivity and enhanced responsiveness to psychostimulants. Hum. Mol. Genet. 17, 3191-3203 (2008).
- Fukuda, E., et al. Down-regulation of protocadherin-alpha A isoforms in mice changes contextual fear conditioning and spatial working memory. Eur. J. Neurosci. 28, 1362-1376 (2008).
- Imayoshi, I., et al. Roles of continuous neurogenesis in the structural and functional integrity of the adult forebrain. Nat. Neurosci. 11, 1153-1161 (2008).
- Nakatani, J., et al. Abnormal behavior in a chromosome-engineered mouse model for human 15q11-13 duplication seen in autism. Cell. 137, 1235-1246 (2009).
- Takao, K., et al. Comprehensive behavioral analysis of calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV Knockout mice. PLoS ONE. 5, (2010).
- Tamada, K., et al. Decreased exploratory activity in a mouse model of 15q duplication syndrome; implications for disturbance of serotonin signaling. PLoS ONE. 5, (2010).
- Watanabe, Y., et al. Relaxin-3-deficient mice showed slight alteration in anxiety-related behavior. Front. Behav. Neurosci. 5, 50 (2011).
- Takeuchi, H., et al. P301S mutant human tau transgenic mice manifest early symptoms of human tauopathies with dementia and altered sensorimotor gating. PLoS ONE. 6, (2011).
- Koshimizu, H., et al. Adenomatous polyposis coli heterozygous knockout mice display hypoactivity and age-dependent working memory deficits. Front. Behav. Neurosci. 5, 85 (2011).
- Yao, I., Takao, K., Miyakawa, T., Ito, S., Setou, M. Synaptic E3 ligase SCRAPPER in contextual fear conditioning: extensive behavioral phenotyping of Scrapper heterozygote and overexpressing mutant mice. PLoS ONE. 6, (2011).
- Shoji, H., et al. Comprehensive behavioral analysis of ENU-induced Disc1-Q31L and -L100P mutant mice. BMC Res. Notes. 5, 108 (2012).
- Anagnostaras, S. G., Josselyn, S. A., Frankland, P. W., Silva, A. J. Computer-assisted behavioral assessment of Pavlovian fear conditioning in mice. Learn. Mem. 7, 58-72 (2000).
- Miyakawa, T., Yamada, M., Duttaroy, A., Wess, J. Hyperactivity and intact hippocampus-dependent learning in mice lacking the M1 muscarinic acetylcholine receptor. J. Neurosci. 21, 5239-5250 (2001).
- Marchand, A. R., Luck, D., DiScala, G. Evaluation of an improved automated analysis of freezing behaviour in rats and its use in trace fear conditioning. J. Neurosci. Methods. 126, 145-153 (2003).
- Kopec, C. D., et al. A robust automated method to analyze rodent motion during fear conditioning. Neuropharmacology. 52, 228-233 (2007).
- Wehner, J. M., et al. Quantitative trait locus analysis of contextual fear conditioning in mice. Nat. Genet. 17, 331-334 (1997).
- Quirk, G. J., Armony, J. L., LeDoux, J. E. Fear conditioning enhances different temporal components of tone-evoked spike trains in auditory cortex and lateral amygdala. Neuron. 19, 613-624 (1997).
- Chaudhury, D., Christopher, S. C. Circadian modulation of learning and memory in fear-conditioned mice. Behav. Brain Res. 133, 95-108 (2002).
- Valentinuzzi, V. S., et al. Effect of circadian phase on context and cued fear conditioning in C57BL/6J mice. Learn. Behav. 29, 133-142 (2001).
- Frankland, P. W., Bontempi, B. The organization of recent and remote memories. Nat. Rev. Neurosci. 6, 119-130 (2005).
- Contarino, A., Baca, L., Kennelly, A., Gold, L. H. Automated assessment of conditioning parameters for context and cued fear in mice. Learn. Mem. 9, 89-96 (2002).
- Kinney, J. W., et al. Deficits in trace cued fear conditioning in galanin-treated rats and galanin-overexpressing transgenic mice. Learn. Mem. 9, 178-190 (2002).
- Hefner, K., Holmes, A. Ontogeny of fear-, anxiety- and depression-related behavior across adolescence in C57BL/6J mice. Behav. Brain Res. 176, 210-215 (2007).
- Wellman, C. L., et al. Impaired stress-coping and fear extinction and abnormal corticolimbic morphology in serotonin transporter knock-out mice. J. Neurosci. 27, 684-691 (2007).
- Valentinuzzi, V. S., et al. Automated measurement of mouse freezing behavior and its use for quantitative trait locus analysis of contextual fear conditioning in (BALB/cJ × C57BL/6J)F2 mice. Learn. Mem. 5, 391-403 (1998).
- Valentinuzzi, V. S., et al. Effect of circadian phase on context and cued fear conditioning in C57BL/6J mice. Learn. Behav. 29, 133-142 (2001).
- Bothe, G. W. M., Bolivar, V. J., Vedder, M. J., Geistfeld, J. G. Genetic and behavioral differences among five inbred mouse strains commonly used in the production of transgenic and knockout mice. Genes Brain Behav. 3, 149-157 (2004).
- Chen, C., Kim, J. J., Thompson, R. F., Tonegawa, S. Hippocampal lesions impair contextual fear conditioning in two strains of mice. Behav. Neurosci. 110, 1177-1180 (1996).
- Anagnostaras, S. G., Gale, G. D., Fanselow, M. S. Hippocampus and contextual fear conditioning: Recent controversies and advances. Hippocampus. 11, 8-17 (2001).
- Akirav, I., Maroun, M. The role of the medial prefrontal cortex-amygdala circuit in stress effects on the extinction of fear. Neural Plast. , 1-11 (2007).
- Johansen, J. P., Cain, C. K., Ostroff, L. E., LeDoux, J. E. Molecular mechanisms of fear learning and memory. Cell. 147, 509-524 (2011).
- Anagnostaras, S. G., et al. Automated assessment of pavlovian conditioned freezing and shock reactivity in mice using the video freeze system. Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).
- Pham, J., Cabrera, S. M., Sanchis-Segura, C., Wood, M. A. Automated scoring of fear-related behavior using EthoVision software. J. Neurosci. Methods. 178, 323-326 (2009).
- Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Crouching as an index of fear. J. Comp. Physiol. Psychol. 67, 370-375 (1969).
- Frankland, P. W., Bontempi, B., Talton, L. E., Kaczmarek, L., Silva, A. J. The involvement of the anterior cingulate cortex in remote contextual fear memory. Science. 304, 881-883 (2004).
- Takao, K., Miyakawa, T. Investigating gene-to-behavior pathways in psychiatric disorders: the use of a comprehensive behavioral test battery on genetically engineered mice. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1086, 144-159 (2006).
- Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Impact of brain-behavior phenotypying of genetically-engineered mice on research of neuropsychiatric disorders. Neurosci. Res. 58, 124-132 (2007).
