Установление минимальной бактерицидной концентрации противомикробного агента для планктонных клеток (MBC-P) и биопленочные клетки (MBC-B)
Summary
Этот протокол позволяет проконтриктное и биопленоконное сопротивление бактериальному штамму, который может образовывать биопленку in vitro с помощью 96-ну микротитрной пластины. Планктонные или биопленопленовиты подвергаются серийным разбавлениям противомикробного агента по выбору. Жизнеспособность можно посвястить росту на агарных пластинах.
Abstract
Этот протокол позволяет пропрямить сопротивление планктонного и биопленки бактериальному штамму, который может образовывать биопленку in vitro. Бактерии прививаются в колодцы 96-ну микротитр пластины. В случае планктонного анализа к бактериальным суспензиям добавляются серийные разбавления противомикробного агента по своему выбору. В анализе биопленки, после прививки, бактерии остаются для формирования биопленки в течение определенного периода времени. Из колодцев удаляются незакрепленные клетки, пополняются средства массовой информации и добавляются серийные разбавления антимикробного агента по выбору. После воздействия противомикробного агента, планктонные клетки проецированы для роста. Для анализа биопленки, средства массовой информации обновляется со свежими средствами массовой информации не хватает противомикробного агента и биопленки клетки остаются для восстановления. Жизнеспособность биопленоплено-клеток анализуется после периода восстановления. MBC-P для противомикробного агента определяется как самая низкая концентрация препарата, который убивает клетки в планктонной культуре. В отличие от этого, MBC-B для штамма определяется путем подвергая предварительной биопленки для увеличения концентрации противомикробного агента в течение 24 часов. MBC-B определяется как самая низкая концентрация противомикробного агента, который убивает клетки в биопленки.
Introduction
Анализ устойчивости к антибиотикам был первоначально разработан для анализа устойчивости планктонных (свободно плавающих) культур бактерий. Поскольку многие бактериальные инфекции связаны с биопленкой (поверхностными клетками), мы были заинтересованы в разработке метода анализа биопленки-специфической устойчивости к антибиотикам. Тем не менее, большинство анализов устойчивости к антибиотикам плохо подходят для измерения устойчивости биопленок. Например, определение минимальной ингибирующей концентрации (ВПК) является золотым стандартом для определения устойчивости к антибиотикам планктонных бактериальных культур 1. Этот анализ влечет за собой смешивание разбавленной планктонной культуры с разбавляя ряд антибиотиков. Концентрация антибиотика, который подавляет видимый рост планктонных клеток является MIC. Поскольку этот анализ опирается на ингибирование роста, по определению, он не может работать с культурами биопленки, что требует изучения чувствительности клеток к антибиотикам в предварительной биопленки. Вместо измерения ингибирования роста, анализ MBC-B, описанный здесь, определяет концентрацию антибиотика, который убивает клетки, уже существующие в биопленки. Таким образом, этот анализ направлен на имитацию лечения антибиотиками установленных биопленоплено инфекций, и обеспечить более релевантное представление о бактериальной устойчивости к антибиотикам in vivo.
Поскольку биопленки, как правило, более устойчивы к антибиотикам, чем планктонные культуры 2-4, необходимо было разработать метод, который непосредственно связывает устойчивость к антибиотикам биопленки с планктонной культурой. Таким образом, еще одна цель этого метода заключается в том, чтобы иметь возможность напрямую сравнить уровень устойчивости к антибиотикам между планктонными и биопленочные клетки. Анализы MBC-P и MBC-B, описанные здесь, делают это возможным, потому что клетки культуризуются в аналогичных условиях. Мы использовали этот метод для изучения нескольких генов, которые имеют важное значение для биопленки конкретных устойчивости к антибиотикам 5-8 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Устойчивость к антибиотикам в планктонных клетках определяется как увеличение минимальной ингибирующей концентрации (ВПК) антибиотика из-за постоянного изменения клеток(например, мутации). Выявленные на сегодняшний день механизмы биопленки или толерантности являются результат…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Автор хотел бы поблагодарить Ли Чжан, Сянь-Чжи Ли, Аарона Хинца и Клейтона Холла за редакционную помощь в этой рукописи. Этот анализ был первоначально разработан в лаборатории Джорджа О’Тула, Гейзельской медицинской школы в Дартмуте. Исследования в лаборатории доктора Ма поддерживается грантами от Природных наук и Инженерных исследований Совета Канады и муковисцидоз Канады.
Materials
|
1x M63 |
Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. |
||
|
KH2PO4 |
Fisher |
P285-500 |
|
|
K2HPO4 |
Fisher |
P288-500 |
|
|
(NH4)2SO4 |
Sigma |
A5132 |
|
|
Magnesium sulfate |
Fisher |
M63-500 |
Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
|
Tobramycin |
Sigma |
Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at –20°C. |
|
|
Arginine |
Sigma |
A5131 |
Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
|
96-well microtiter plates |
Corning |
3595 |
Sterile, flat-bottom, low evaporation |
|
Tranferpette (multichannel pipette) |
BrandTech |
2703610 |
8-channel, 20-200 μl |
|
Multiprong device |
Dan-Kar |
MC48 |
48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate |
References
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
- Mah, T. F., O’Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
- Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O’Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Zhang, L., Mah, T. F. The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics. J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).
- Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance. J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
- Lewis, K. Multidrug tolerance of biofilms and persister cells. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and Analyzing Static Biofilms. Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.1.1-1B.1.17 (2005).
- Ramey, B. E., Parsek, M. R. Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters. Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.3.1-1B.3.14 (2005).
