Zebrafisk har været et værdifuldt redskab for mange forskningsområder. Her vi demonstrere en metode til at fremkalde en visuel reaktion og beregne en funktionel synsstyrke i den voksne zebrafisk.
Zebrafisk er en gennemprøvet model for vision forskning, men mange af de tidligere metoder, der generelt fokuseret på fiskelarver eller demonstreret et simpelt svar. For nylig voksen visuel adfærd i zebrafisk er blevet af interesse, men metoder til at måle specifikke svar er nye på vej. For at løse dette hul, vi satte sig for at udvikle en metode til gentagne gange og præcist udnytte optokinetic respons (OKR) til at måle synsstyrke i voksen zebrafisk. Her viser vi, at der kan måles den voksne zebrafisk visuelle skarphed, herunder både kikkerter og monokulare acuities. Fordi fisken ikke skades under proceduren, kan måles synsstyrke og sammenlignes over kortere eller længere perioder. Synsstyrke målinger der er beskrevet her, kan også gøres hurtigt giver mulighed for høj kapacitet og yderligere visuelle procedurer, hvis det ønskes. Denne type analyse er befordrende for narkotika interventionsstudier eller undersøgelser af sygdomsprogression.
Zebrafisk (Danio rerio), er en god model til at studere visuel fysiologi på grund af ligheden af deres nethinden til andre hvirveldyr, deres korte levetid, og tilgængeligheden af genetisk ændrede mutanter 1,2. Den optokinetic refleks / respons / nystagmus (OKR) er en kombination af glat forfølgelse og hurtige saccade øjenbevægelser. For mere end 60 år klinikere har vist, at OKR kan bruges til objektivt at måle synsstyrke hos patienter og er især nyttig til at bestemme spædbarn visuelle evner 3-5. Den første registrerede brug af OKR i dyr var ved hjælp af duer i 1950'erne 6. For nylig har OKR blevet et værdifuldt redskab til at vurdere den visuelle funktion i larvernes zebrafisk og er ofte brugt til at screene for genetiske mutanter, der har en synshandicappet 1,2. Mens OKR har været meget anvendt til at bestemme visuel funktion i larve zebrafisk, er det først for nylig blevet påvist i voksne zebrafiske 7-10. En nylig papir ved Tappeiner bruger en kommercielt tilgængelig optomotor systemet traditionelt anvendes til mus et al., OptoMotry, at påvise, at synsstyrke den voksne zebrafisk stadig temmelig konstant, ~ 0,59 cykler per grad (CPD), også på tværs af forskellige vinkelhastigheder 7 .
Selvom OKR har vist sig at være ganske nyttigt i larvernes zebrafisk undersøgelser har andre metoder til visuel adfærd blevet brugt i zebrafisk voksne med varierende grader af succes. Flugten respons assay viste, at albino og rubin zebrafisk begge pigmentering mutanter, har reduceret visuelle reaktioner i lyse lysforhold 11,12. Denne samme flugt respons assay har også med succes identificeret nat blindhed D mutanter, omend på 2 år 13. Imidlertid flugtrespons assayet er ikke uden mangler. Det er svært at tilskrive en nøjagtig visuel funktion og er kun en grov approximation af visuelle ændringer – betyder, at det tager en stor ændring, før ændringen er identificeret.
En anden metode, der er udviklet til at identificere voksne zebrafisk med synshandicap er optomotor respons (OMR) 11. I dette assay er fisk anbragt i en cirkulær tank med en uigennemsigtig spalte i midten. Sorte og hvide striber roterer omkring tanken, og fisken har til opgave at svømme i retning af stribe bevægelse. Ligesom flugt reaktion, OMR fokuserer på visuomotor kapaciteter af den voksne zebrafisk. Det har dog været anvendt med succes til at identificere fisk med synshandicap, såsom lrp2/bugeye mutanter 14. De lrp2/bugeye zebrafisk udstille buphthalmos, forhøjet intraokulært tryk, formindsket OMR og progressiv retinal degeneration 14,15.
Mange undersøgelser har brugt visuomotor kapaciteter i voksen zebrafisk, som ofte er subjektive og ikke kan Quantitatively analyseret. Ved at bruge OKR, kan man studere synsstyrke voksne fisk mere objektivt. Vi har bygget vores egen OKR-enhed, modelleret efter et oprindeligt brugt til larve undersøgelser 1.. I denne undersøgelse har vi vise, at OKR kan bruges til at beregne både monokulære og binokulære synsstyrke i zebrafisk.
Til tider fiskene kan slippe ud i vandbeholderen. Det er afgørende at immobilisere halen. Derudover brugen af en tynd svamp / håndklæde over fisken krop blev også fundet at være uvurderlig for at holde fiskene suspenderet i længere tid. Vi var i stand til at holde fisk immobiliseret i mere end 30 min ved hjælp af denne procedure uden at skade fisken. Denne mængde tid er mere end nok til at gøre kikkerten og begge monokulare acuities.
Præsentationen af risten kan enten gøres som beskrevet her og andre steder ved hjælp af en fysisk roterende tromle eller ved at præsentere et digitalt display 18-22. Begge typer har særlige fordele og ulemper. Vi valgte at bruge den fysiske rotation både omkostningsmæssige årsager og tekniske specifikationer. Eksklusive computeren og imaging udstyr, kan det OKR anordning beskrevet her blive bygget for omkring 150 dollar.
Den OKR er en objektiv metode til bestemmelse visual skarphed i voksen zebrafisk. Mens flere andre visuomotor assays for syn er anvendt i tidligere eksperimenter og endda elektroretinogrammet er med held blevet udført i voksne zebrafisk øjne, selv om det ikke har været stærkt udnyttet den voksne zebrafisk OKR åbner døren til mange nye eksperimentelle betingelser 22. Denne undersøgelse har vist, at OKR anvendelighed måle synsstyrke ændringer over tid, identificere synsstyrke forskel i øjet sygdomsmodeller, og i fastsættelsen af monokulært synsstyrke.
Interessant, voksen zebrafisk vision i forhold til menneskets syn (20/20) er ca 20/1, 000 (når 0,60 cpd omdannes til -0.3 logMAR). Selv om dette kan synes dårlig, er zebrafisk øjne meget velegnet til miljøet. På trods af den visuelle opgave at kigge gennem 6,5 cm vand, et par millimeter af polycarbonat, og en anden centimeter af luft, fiskene udføre ganske godt! Vi fandt, at den voksne zebrafisk skarphed er ABOut 70% af, hvad der kunne forventes i betragtning af deres fotoreceptorer afstand. 23. Kontrast, at med optimal menneskelig ydeevne ~ 20/12, hvilket er omkring 80% af den forventede 20/10, og OKR teknik til at måle visuel kapacitet i voksen zebrafisk er imponerende 24 25.
Teknikken med at måle uafhængige øjet visuelle acuities giver mulighed for studier, hvor det ene øje kunne være behandlet, og den anden bruges som en kontrol. Derudover kunne fiske med asymmetrisk udvikling øje såsom lrp2/bugeye eller fisk, der udvikler grå stær overvåges mere præcist. Det skal bemærkes, at pleje skal tages for at præcist at måle afstanden fra øjnene til striberne, og at okkludere den fulde synsfelt. Denne teknik skal åbne døren til mere præcise og specifikke foranstaltninger af zebrafisk visuel funktion.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering fra Western University of Health Sciences College of Optometri til DJC. Særlig tak til Irisa Tam til grafisk design.
Super Low Light Black White Video Security Camera | Super Circuits | PC164CEX-2 | Any low light camera may be used |
Arduino Duemilanove microcontroller | Adafruit Industries | The Arduino Uno is also compatible with the speed control software. | |
Tricaine Methanesulfonate | VWR | 101107-950 |