시험관 내 병원균 유도 호중구 트랜스 상피 이동을 평가하는 공동 문화 분석
Summary
점막 세균 감염에 응하여 호중구 트랜스 상피 이동은 상피 손상 및 임상 질병에 기여합니다. 시험관 내 모델은 병원체, 인간 호중구 및 트랜스웰 필터에서 자란 편광 된 인간 상피 세포 층을 결합하여이 현상을 조율하는 분자 메커니즘을 해명하는 쪽으로 조사를 용이하게하는 것으로 개발되었습니다.
Abstract
점막 표면은 병원성 유기체에 대한 보호 장벽 역할을합니다. 선천성 면역 반응은 주로 호중구를 마이그레이션하는 염증 세포와 조직의 침투로 이어지는 병원균을 감지할 때 활성화됩니다. 이 과정은 과도하거나 해결되지 않은 상태로 유지되는 경우 조직에 파괴적 일 가능성이 있습니다. 체외 모델의 공동 배양은 병원체 유도 호중구 트랜스 상피 이동에 관여하는 독특한 분자 메커니즘을 연구하기 위해 활용될 수 있다. 이 유형의 모델은 병원체, 상피 장벽 또는 호중구의 제어 조작기회를 통해 실험 설계의 다기능성을 제공합니다. 투과성 트랜스웰 필터에서 자란 편극상 단층의 정량적 표면의 병원성 감염은 생리학적으로 관련된 바소포탈을 유혈성 호중구 표면에 적용한다. 본 명세서에서 기술된 시험관 내 모델은 병원성 P. aeruginosa (PAO1)에 감염된 편광폐 상피 단층을 통해 호중구 이주를 입증하는 데 필요한 다중 단계를 보여줍니다. 인간 유래 폐 상피 세포와 투과성 트랜스웰의 파종 및 배양은 전체 인간의 혈액으로부터 호중구의 격리와 함께 PAO1 및 비병원성 K12 E. 대장균(MC1000)의 배양과 함께 설명된다. 병원성 감염에 대응하여 동원된 성공적으로 이주한 호중구의 이민 과정 및 정량적 분석은 양성 및 음의 대조군을 포함한 대표적인 데이터로 나타난다. 이 시험관 내 모델 시스템은 조작하여 다른 점막 표면에 적용할 수 있습니다. 과도 한 호중구 침투를 포함 하는 염증 성 응답 호스트 조직에 파괴 될 수 있으며 병원 성 감염의 부재에서 발생할 수 있습니다. 본 명세서에 기재된 체외 공동학 분석 시스템의 실험적 조작을 통해 호중구 트랜스 상피 이동을 촉진하는 분자 메커니즘에 대한 더 나은 이해는 염증성 질환뿐만 아니라 다양한 점막 전염에 대한 새로운 치료 목표를 식별할 수 있는 중요한 잠재력을 가지고 있다.
Introduction
점막 표면은 환경에 만연한 외부 위협에 대한 보호를 제공하는 물리적 및 면역학 장벽 역할을한다 1,2. 병원성 유기체가2를침공할 때 이러한 보호 상피 장벽이 손상될 수 있다. 세균성 병원균의 경우, 이러한 만남은 종종 선천성 면역 체계를 활성화하고 호중구로 알려진 응급 구조자 과립구의 신속한 동원을 유발하여 염증 과정을선동2-4. 호중구 모집을 용이하게 하는 항암제는2-4의상피성 세포를 제거하려는 점막 상피 세포에 의해 부분적으로 생성된다. 점막 상피 표면의 과도하거나 해결되지 않은 호중구 침투는 중요한 병리학을 유발할 수있다 1,5. 이는 항균 호중구 무기고5-7에의한 비특이적 조직 손상의 결과입니다. 이러한 경우에, 호중구의 세균성 통관 능력은 전염성 모욕 도중 호스트 조직의 파괴에 의해 가려져 있습니다. 보호 상피 장벽 기능의 중단은 미생물 및 / 또는 독소에 기본 조직의 향상된 노출로 이어질 수 있습니다, 질병 병리학을 더욱 악화8,9. 이러한 결과는 폐 및 소화관을 포함한 여러 장기 시스템에서 관찰될 수 있다1,5. 더욱이, 천식의 심한 시합, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 염증성 장질환(IBD) 등 비감염성 질환은 과도한 호중구 반응에 의한 점막 상피 장벽의 병리학적 위반에 의해 표시된다4,5,10-12.
점막 감염 에 따른 호중구 모집의 복잡한 과정은 여러 구획 단계1,5,13,14를포함한다. 첫째, 호중구는 내피 이동1,13을용이하게 하는 일련의 세포 대 세포 상호 작용을 통해 순환에서 출발해야 한다. 호중구는 다음 세포 외 매트릭스를 포함하는 기존의 중간 공간을 탐색1,14. 감염된 점막의 루멘에 도달하려면 호중구는 상피 장벽1,4,5를가로 질러 이동해야합니다. 이 복잡한 다단계 현상은 감염15의생체 내 동물 모형을 사용하여 집계에서 수시로 조사됩니다. 이러한 모델은 전체 공정에 참여하지만 각 뚜렷한 구획화단계(16)에중요한 분자 기여도를 해결하기에는 크게 부적당한 체모키인, 접착 분자 또는 신호 경로와 같은 특정 요인의 필요성을 확립하는 데 유용하다. 호중구의 트랜스 내피, 트랜스 매트릭스 또는 트랜스 상피 이동을 모델링하는 시험관 내 시스템 내계가1,14,16,17에서특히 유용하였다.
견고한 동문화 분석 시스템은 병원성 감염18-22에대응하여 호중구 트랜스 상피 이동을 담당하는 메커니즘을 해독하기 위한 목적으로 개발되었다. 이 모형은 세균성 병원체를 가진 편광된 인간 상피 세포 층의 정압 표면을 감염시키는 것을 관련시킵니다18-22바칼측 표면에 새로 고립된 인간 호중구의 적용에 선행된. 호중구는 상피 유래 화학 물질 제품에 대한 응답으로 상피 장벽을 가로 질러 이동18,21-23병원성 감염 다음 분비. 본 모델 시스템은 적절한 조직 특정 세균병원균에 노출된 장 및 폐 상피 배양을 사용하여 사용되었으며 점막 감염 시 호중구 모집 과정에 중요한 새로운 분자 메커니즘을3,8,19,24-28로발표했다. 이 체외 공동문화 모델의 강점은 감소주의자 접근법을 통해 조사관이 잘 통제되고, 매우 재현가능하고, 상당히 저렴한 시스템에서 병원체, 상피 장벽 및/또는 호중구를 실험적으로 조작할 수 있게 한다는 것입니다. 이러한 접근법으로부터 수집된 통찰력은 생체 내 감염 모델22,29,30을사용하여 호중구 모집 중 구획화 된 사건의 집중분석을 수행하기 위해 효과적으로 활용할 수 있다.
이 문서에서는 병원균 유도 호중구 트랜스 상피 이동을 탐구하기 위해이 재현 가능한 모델의 성공적인 설립에 필요한 여러 단계를 보여줍니다. 병원균 슈도모나스 아에루기노사에 감염된 폐 상피 장벽은 이 논문에 등장한다. 그러나, 그밖 조직 상피및 병원체는 경미한 수정으로 대체될 수 있습니다. 겨드개한 콜라겐 코팅 투과성 트랜스웰 필터에 편광 폐 상피 세포 층의 파종 및 배양은 병원성 P. aeruginosa의 성장과 전혈에서 호중구의 격리와 마찬가지로 본원에 상세합니다. 이러한 성분들이 병원균 유발 호중구 트랜스 상피 이동을 관찰하기 위해 결합되는 방법은 재현 가능한 분석법을 확립하기 위해 적절한 양성 및 음수 제어와 함께 제시된다. 병원체 유도 호중구 트랜스 상피 이동의 다양한 측면을 검사하는이 접근 방식의 다양성은 문학에서 특정 연구에 대한 참조와 함께 논의된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
점막 상피 표면을 가로지르는 호중구 이동은 세균병원균3을가진 감염 다음 질병 병리학에서 일반적인 특징이다. 본 명세서에 기재된 방법론은 세균 감염에 의해 유발되는 염증 과정의 특징을 모델하는 체외 공동문화 분석 시스템에서 유래된 인간 세포를 사용하여 이 개별 이벤트를 실험적으로 격리하는 신속하고 간단한 접근법을 제공한다. 본 시스템은 원래 살모넬라 티피무륨…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH (1 R01 AI095338-01A1)에 의해 재정적으로 지원되었습니다.
Materials
| NCl-H292 cells | ATCC | CRL-1848 | |
| RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | ATCC | #47085 | |
| Escherichia coli MC1000 | ATCC | #39531 | |
| D-PBS (1x) liquid | Invitrogen | 14190-144 | without calcium and magnesium |
| Heat Inactivated Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-147 | 10% added to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 100x: 10,000 units of penicillin and 10,000 µg of streptomycin per ml. |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300-062 | 50 ml aliquots are stored frozen at -20 ºC. Aliquot in use can be stored at 4 ºC short-term. |
| Hank's Balanced Salt Solution – HBSS(-) | Invitrogen | 14175-079 | Sterile, without calcium and magnesium |
| Trypan Blue Solution | Invitrogen | 15250-061. | Stock = 0.4% |
| Collagen, Rat Tail | Invitrogen | A10483-01 | Can also be isolated in the laboratory directly from the tails of rats using standard protocols |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909-500G | Component of 1 M citrate buffer and acid citrate dextrose (ACD) solution |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641-500G | Component of 1 M citrate buffer |
| Dextrose anhydrous | Sigma-Aldrich | D8066-250G | Component of acid citrate dextrose (ACD) solution |
| Ammonium Chloride | Sigma-Aldrich | 213330-500G | Component of red blood cell (RBC) lysis buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-500G | Component of red blood cell (RBC) lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED-100G | Component of red blood cell (RBC) lysis buffer |
| HBSS(+) powder | Sigma-Aldrich | H1387-10L | Key component of HBSS+ |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-500G | Component of HBSS+ |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | Follow vendor instructions to coat glass pipette tips |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) | Sigma-Aldrich | A9941-50TAB | Key component of ABTS substrate solution |
| 30% Hydrogen Peroxide Solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Component of ABTS substrate solution |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP or fMLF) | Sigma-Aldrich | F-3506 | A Stock solution of 10 mM in DMSO should be prepared and aliquots stored at -20 ºC. |
| Gelatin Type B | Fisher Scientific | M-12026 | |
| Pseudomonas isolation agar | Fisher Scientific | DF0927-17-1 | Follow manufacturer’s instructions to make PIA plates |
| Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-749 | Optional, can improve neutrophil purity |
| Name of Material / Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well migration plate | Corning Incorporated | #3524 | |
| 24-well wash plate | Falcon | 35-1147 | Can be reused if soaked in 70% ethanol and washed thoroughly prior to reuse |
| 96-well plate | Fisher Scientific | #12565501 | |
| Transwell Permeable Supports | Corning Incorporated | #3415 | Polycarbonate; Diameter: 6.5 mm; Growth area: 0.33 cm2; Dish style: 24-well plate; Pore size: 3.0 µm |
| Petri dish | Falcon | 35-1013 | Each Petri dish holds 24 inverted 0.33 cm2 Transwells. |
| 500 ml 0.2 μm filter / flask | Fisher Scientific | 09-740-25A | To sterilize acid citrate dextrose (ACD) solution |
| 5-3/4 in glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | Coat tips with Sigmacote prior to use |
| Hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | Curved, Serrated |
| Invertoskop Inverted Microscope | Zeiss | #342222 | |
| Versa-Max Microplate Reader | Molecular Devices | #432789 |
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