JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

In vitro Coculture Assay om pathogene geïnduceerde neutrofiele trans-epitheliale migratie te beoordelen

Published: January 06, 2014
doi:
10.3791/50823
, , ,
1Department of Pediatrics,Harvard Medical School, 2Department of Pediatric Gastroenterology,MGH for Children, 3Mucosal Immunology and Biology Research Center,Massachusetts General Hospital

Summary

Neutrofiele trans-epitheliale migratie als reactie op mucosale bacteriële infectie draagt bij aan epitheelletsel en klinische ziekte. Er is een in vitro model ontwikkeld dat pathogene, menselijke neutrofielen en gepolariseerde menselijke epitheelcellagen combineert die op transwellfilters zijn gekweekt om onderzoeken naar het ontrafelen van de moleculaire mechanismen die dit fenomeen orkestreren te vergemakkelijken.

Abstract

Mucosale oppervlakken dienen als beschermende barrières tegen pathogene organismen. Aangeboren immuunreacties worden geactiveerd bij het detecteren van pathogenen die leiden tot de infiltratie van weefsels met migrerende ontstekingscellen, voornamelijk neutrofielen. Dit proces heeft het potentieel om destructief te zijn voor weefsels als het overmatig is of in een onopgeloste toestand wordt gehouden.  Gecocultureerde in vitro modellen kunnen worden gebruikt om de unieke moleculaire mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij pathogene geïnduceerde neutrofiele trans-epitheliale migratie. Dit type model biedt veelzijdigheid in experimenteel ontwerp met de mogelijkheid voor gecontroleerde manipulatie van de ziekteverwekker, epitheelbarrière of neutrofiel. Pathogene infectie van het apicale oppervlak van gepolariseerde epitheliale monolagen gekweekt op permeabele transwellfilters veroorzaakt fysiologisch relevante basolaterale tot apicale transepitheelmigratie van neutrofielen die op het basolaterale oppervlak worden toegepast. Het hierin beschreven in vitro model toont de vele stappen aan die nodig zijn om neutrofiele migratie aan te tonen over een gepolariseerde longepitheelmonolayer die is geïnfecteerd met pathogene P. aeruginosa (PAO1). Zaaien en cultiveren van doorlatende transwells met menselijke afgeleide longepitheelcellen wordt beschreven, samen met isolatie van neutrofielen uit volledig menselijk bloed en cultivering van PAO1 en nietpathogene K12 E. coli (MC1000).  Het emigratieproces en de kwantitatieve analyse van met succes gemigreerde neutrofielen die zijn gemobiliseerd als reactie op pathogene infectie, worden aangetoond met representatieve gegevens, waaronder positieve en negatieve controles. Dit in vitro modelsysteem kan worden gemanipuleerd en toegepast op andere mucosale oppervlakken. Ontstekingsreacties waarbij overmatige neutrofiele infiltratie betrokken is, kunnen destructief zijn voor gastheerweefsels en kunnen optreden bij afwezigheid van pathogene infecties. Een beter begrip van de moleculaire mechanismen die neutrofiele transepitheelmigratie bevorderen door experimentele manipulatie van het in vitro coculture assay-systeem dat hierin wordt beschreven, heeft een aanzienlijk potentieel om nieuwe therapeutische doelen te identificeren voor een reeks mucosale infectieuze en inflammatoire ziekten.

Introduction

Mucosale oppervlakken dienen als fysieke en immunologische barrières die bescherming bieden tegen externe bedreigingen die alomtegenwoordig zijn in het milieu1,2. Deze beschermende epitheelbarrière kan worden aangetast wanneer pathogene organismen binnendringen2. In het geval van een bacteriële ziekteverwekker veroorzaakt deze ontmoeting vaak een ontstekingsproces door het aangeboren immuunsysteem te activeren en een snelle mobilisatie van eerstehulpgranulocyten bekend als neutrofielen2-4te activeren . Chemotactische middelen die neutrofiele rekrutering vergemakkelijken, worden gedeeltelijk geproduceerd door de mucosale epitheelcellen die de gastheer van de beledigende ziekteverwekker2-4willen bevrijden. Overmatige of onopgeloste neutrofiele infiltratie van het mucosale epitheeloppervlak kan significante pathologie veroorzaken1,5. Dit is een gevolg van niet-specifieke weefselschade veroorzaakt door het antibacteriële neutrofielenarsenaal5-7. In dergelijke gevallen wordt de bacteriële klaringscapaciteit van neutrofielen overschaduwd door vernietiging van gastheerweefsel tijdens een infectieuze belediging.  Verstoring van de beschermende epitheliale barrièrefunctie kan leiden tot een verhoogde blootstelling van onderliggend weefsel aan micro-organismen en/of toxines, waardoor de ziektepathologie verder wordt verergerd8,9. Deze gevolgen kunnen worden waargenomen in meerdere orgaansystemen, waaronder de longen en het spijsverteringskanaal1,5. Bovendien worden niet-infectieuze ontstekingsaandoeningen zoals ernstige aanvallen van astma, chronische obstructieve longziekte (COPD), acuut respiratoir distress syndroom (ARDS) en inflammatoire darmziekte (IBD) gekenmerkt door de pathologische breuk van de mucosale epitheelbarrière door een overmatige neutrofiele respons4,5,10-12.

Het complexe proces van neutrofiele rekrutering na mucosale infectie omvat verschillende gecompartimenteerde stappen1,5,13,14. Ten eerste moeten neutrofielen uit de circulatie vertrekken via een reeks cel-naar-celinteracties die trans-endotheelmigratie vergemakkelijken1,13. Neutrofielen navigeren vervolgens door bestaande interstitiële ruimte met extracellulaire matrix1,14. Om het lumen van het geïnfecteerde slijmvlies te bereiken, moeten neutrofielen vervolgens migreren over de epitheelbarrière1,4,5. Dit ingewikkelde multistep-fenomeen wordt vaak in geaggregeerde zin onderzocht met behulp van in vivo diermodellen van infectie15. Dergelijke modellen zijn nuttig om de noodzaak vast te stellen van specifieke factoren, zoals chemokinen, adhesiemoleculen of signaleringsroutes die deelnemen aan het algehele proces, maar zijn grotendeels ontoereikend voor het oplossen van moleculaire bijdragen die van cruciaal belang zijn voor elke afzonderlijke gecompartimenteerde stap16. Coculturele in vitro systemen die trans-endotheel-, transmatrix- of transepitheelmigratie van neutrofielen modelleren, zijn in dit opzicht bijzonder nuttig geweest1,14,16,17.

Er is een robuust coculture-assaysysteem ontwikkeld voor het ontcijferen van mechanismen die verantwoordelijk zijn voor neutrofiele transepitheelmigratie als reactie op pathogene infectie18-22. Dit model omvat het infecteren van het apicale oppervlak van gepolariseerde menselijke epitheelcellagen met een bacteriële ziekteverwekker gevolgd door toepassing van vers geïsoleerde menselijke neutrofielen op het basolaterale oppervlak18-22. Neutrofielen migreren over de epitheelbarrière als reactie op epitheliale chemotactische producten die zijn uitgescheiden na pathogene infectie18,21-23. Dit modelsysteem is gebruikt met behulp van intestinale en longepitheelculturen die zijn blootgesteld aan geschikte weefselspecifieke bacteriële pathogenen en heeft nieuwe moleculaire mechanismen onthuld die waarschijnlijk belangrijk zijn voor het wervingsproces van neutrofielen tijdens mucosale infectie3,8,19,24-28. De kracht van dit in vitro coculture model is dat een reductionistische benadering de onderzoeker in staat stelt om de ziekteverwekker, epitheelbarrière en/of neutrofiel experimenteel te manipuleren in een goed gecontroleerd, zeer reproduceerbaar, vrij goedkoop systeem. Inzicht verkregen uit deze aanpak kan effectief worden gebruikt om gerichte analyse uit te voeren van gecompartimenteerde gebeurtenissen tijdens neutrofiele rekrutering met behulp van in vivo infectiemodellen22,29,30.

Dit artikel demonstreert de meerdere stappen die nodig zijn voor de succesvolle vaststelling van dit reproduceerbare model om pathogene geïnduceerde neutrofiele trans-epitheelmigratie te onderzoeken. Longepitheelbarrières geïnfecteerd met de ziekteverwekker Pseudomonas aeruginosa komen in dit artikel voor; andere weefselepithlia en pathogenen kunnen echter worden vervangen door kleine wijzigingen. Zaaien en cultiveren van gepolariseerde longepitheelcellagen op omgekeerde collageen gecoate permeabele transwellfilters wordt hierin beschreven, net als de groei van pathogene P. aeruginosa en de isolatie van neutrofielen uit volbloed. Hoe deze componenten worden gecombineerd om door pathogenen geïnduceerde neutrofiele transepitheelmigratie te observeren, wordt gepresenteerd, samen met passende positieve en negatieve controles om een reproduceerbare test vast te stellen. De veelzijdigheid van deze benadering om verschillende aspecten van pathogene geïnduceerde neutrofiele transepitheelmigratie te onderzoeken, wordt besproken met betrekking tot specifieke studies in de literatuur.

Protocol

Stappen (1-3) moeten worden uitgevoerd in een steriele omgeving onder een laminaire stromingskap. 1. Collageen coating transwells Maak een collageenoplossing van 30 μg/ml. Verdun 3 mg/ml collageenbouillon 1:100 in 60% ethanol die door een filtereenheid van 0,2 μm is gegaan. Vortex verdunde oplossing van 30 μg/ml. Opmerking: Het is niet nodig om de 3 mg/ml collageenbouillonoplossing te vortexen, omdat deze oplossing vrij stroperig is en luchtbellen kunnen worden…

Representative Results

Verschillende studies hebben aangetoond dat met ziekteverwekkers geïnfecteerde epitheellagen neutrofiele transepitheelmigratie vergemakkelijken3,8,19,24-28,31,32. Dit gebeurt via een pathogene-specifieke inductie van een epitheelcel-afgeleide neutrofiele chemotactische gradiënt3,23. Bijvoorbeeld, pathogene P. aeruginosa interactie met het apicale oppervlak van longepitheelcellen zorgt ervoor dat een aanzienlijk aantal neutrofielen migreren over de epitheellaag18,22,25,26,33,34….

Discussion

Neutrofiele migratie over mucosale epitheeloppervlakken is een veel voorkomend kenmerk in ziektepathologie na infectie met bacteriële pathogenen3. De hierin beschreven methodologie biedt een snelle, eenvoudige aanpak om deze discrete gebeurtenis experimenteel te isoleren met behulp van een in vitro coculture assay-systeem dat een kenmerk modelleert van het ontstekingsproces dat wordt veroorzaakt door bacteriële infecties. Dit systeem werd oorspronkelijk ontwikkeld met behulp van gepolariseerde intes…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd financieel ondersteund door NIH (1 R01 AI095338-01A1).

Materials

NCl-H292 cells ATCC CRL-1848
RPMI-1640 medium ATCC 30-2001
Pseudomonas aeruginosa PAO1 ATCC #47085
Escherichia coli MC1000 ATCC #39531
D-PBS (1x) liquid Invitrogen 14190-144 without calcium and magnesium
Heat Inactivated Fetal bovine serum Invitrogen 10082-147 10% added to culture medium
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-122 100x: 10,000 units of penicillin and 10,000 µg of streptomycin per ml.
Trypsin-EDTA (0.05%) Invitrogen 25300-062 50 ml aliquots are stored frozen at -20 ºC.  Aliquot in use can be stored at 4 ºC short-term.  
Hank's Balanced Salt Solution – HBSS(-) Invitrogen 14175-079 Sterile, without calcium and magnesium
Trypan Blue Solution Invitrogen 15250-061. Stock = 0.4%
Collagen, Rat Tail Invitrogen A10483-01 Can also be isolated in the laboratory directly from the tails of rats using standard protocols
Citric acid Sigma-Aldrich  C1909-500G Component of 1 M citrate buffer and acid citrate dextrose (ACD) solution
Sodium Citrate Sigma-Aldrich  S4641-500G Component of 1 M citrate buffer
Dextrose anhydrous Sigma-Aldrich  D8066-250G Component of acid citrate dextrose (ACD) solution
Ammonium Chloride Sigma-Aldrich  213330-500G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich  S6014-500G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
EDTA Sigma-Aldrich  ED-100G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
HBSS(+) powder Sigma-Aldrich  H1387-10L Key component of HBSS+
HEPES Sigma-Aldrich  H3375-500G Component of HBSS+
Sigmacote Sigma-Aldrich  SL2-25ML Follow vendor instructions to coat glass pipette tips
Triton X-100 Sigma-Aldrich  T-9284
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) Sigma-Aldrich  A9941-50TAB Key component of ABTS substrate solution
30% Hydrogen Peroxide Solution Sigma-Aldrich  H1009-100ML Component of ABTS substrate solution
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP or fMLF) Sigma-Aldrich  F-3506 A Stock solution of 10 mM in DMSO should be prepared and aliquots stored at -20 ºC.
Gelatin Type B Fisher Scientific M-12026
Pseudomonas isolation agar  Fisher Scientific DF0927-17-1 Follow manufacturer’s instructions to make PIA plates
Ficoll-Paque PLUS  Fisher Scientific 45-001-749 Optional, can improve neutrophil purity
Name of Material / Equipment Company Catalog Number Comments
24-well migration plate Corning Incorporated #3524
24-well wash plate Falcon 35-1147 Can be reused if soaked in 70% ethanol and washed thoroughly prior to reuse
96-well plate Fisher Scientific #12565501
Transwell Permeable Supports  Corning Incorporated #3415 Polycarbonate; Diameter: 6.5 mm; Growth area: 0.33 cm2; Dish style: 24-well plate; Pore size: 3.0 µm
Petri dish Falcon 35-1013 Each Petri dish holds 24 inverted 0.33 cm2 Transwells.  
500 ml 0.2 μm filter / flask Fisher Scientific 09-740-25A To sterilize acid citrate dextrose (ACD) solution
5-3/4 in glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-20A Coat tips with Sigmacote prior to use
Hemostat Fisher Scientific 13-812-14 Curved, Serrated
Invertoskop Inverted Microscope Zeiss #342222
Versa-Max Microplate Reader Molecular Devices #432789
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung. Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).
  2. Hurley, B. P., McCormick, B. A. Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats. Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).
  3. McCormick, B. A. Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator. FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).
  4. Mumy, K. L., McCormick, B. A. The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).
  5. Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
  6. Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. The paradox of the neutrophil’s role in tissue injury. J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).
  7. Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).
  8. Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration. Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).
  9. Kohler, H., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).
  10. Gane, J., Stockley, R. Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD. Thorax. 67, 553-561 (2012).
  11. Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol. Med. 17, 293-307 (2011).
  12. Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. Neutrophilic inflammation in severe asthma. Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).
  13. Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. Mechanisms of neutrophil transendothelial migration. Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).
  14. Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).
  15. Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).
  16. Hurley, B. P., McCormick, B. A. Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium. Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).
  17. Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
  18. Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3. J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).
  19. McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils. J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).
  20. McCormick, B. A., et al. Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils. J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).
  21. Mrsny, R. J., et al. Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).
  22. Tamang, D. L., et al. Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers. J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).
  23. McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium. J. Immunol. 160, 455-466 (1998).
  24. Boll, E. J., et al. Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway. Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).
  25. Hurley, B. P., et al. The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells. Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).
  26. Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).
  27. McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium. Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).
  28. Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils. Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).
  29. Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection. Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).
  30. Pazos, M., et al. Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3. J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).
  31. Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
  32. Bhowmick, R., et al. Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation. J. Immunol. , (2013).
  33. Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).
  34. Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration. Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).
  35. Frank, D. W. Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions.. Front. Microbiol. 3, 20 (2012).
  36. Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Lung infections associated with cystic fibrosis. Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).
  37. Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium. Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).
  38. Kierbel, A., et al. Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane. J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).
  39. Lee, C. A., et al. A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).
  40. Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein. Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).
  41. Brazil, J. C., et al. Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface. J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).
  42. Lawrence, D. W., et al. Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia. J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).
  43. Hodges, K., Hecht, G. Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response. J. Physiol. 590, 433-440 (2012).

Tags

In Vitro CocultureNeutrophil Trans-epithelial MigrationMucosal ImmunityPathogenic InfectionPolarized Epithelial MonolayerNeutrophil InfiltrationInflammatory ResponseTherapeutic Targets

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Kusek, M. E., Pazos, M. A., Pirzai, W., Hurley, B. P. In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration. J. Vis. Exp. (83), e50823, doi:10.3791/50823 (2014).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image