تقنية لدراسة المفصلية والمجتمعات الميكروبية داخل شجرة الأنسجة
Summary
We provide a technique to preserve intact tree phloem and prepare it for observation. We create an apparatus called a phloem sandwich that allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms that inhabit phloem tissues.
Abstract
Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms. Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear young, feed, or hide from natural enemies or harsh environmental conditions outside of the tree. Organisms that persist within the phloem habitat are difficult to observe given their location under bark. We provide a technique to preserve intact phloem and prepare it for experimentation with invertebrates and microorganisms. The apparatus is called a ‘phloem sandwich’ and allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms. This technique has resulted in a better understanding of the feeding behaviors, life-history traits, reproduction, development, and interactions of organisms within tree phloem. The strengths of this technique include the use of inexpensive materials, variability in sandwich size, flexibility to re-open the sandwich or introduce multiple organisms through drilled holes, and the preservation and maintenance of phloem integrity. The phloem sandwich is an excellent educational tool for scientific discovery in both K-12 science courses and university research laboratories.
Introduction
اللحاء واللحاء الأنسجة من الصنوبريات هي المضيفة لآلاف الكائنات الحية. Phloeophagy والتغذية على أنسجة اللحاء من اللحاء الداخلي، هو عادة ترتبط عادة مع خنافس اللحاء، woodborers، وعدد آخر من الأصناف اللافقاريات والميكروبات التي تعيش داخل الأشجار 23 خنافس اللحاء. (غمدية الأجنحة: السدر) تطوير والعيش داخل اللحاء إلا ل فترات قصيرة عندما تسعى البالغين الأشجار المضيفة الجديدة. وقد تم دراسة 31 خنافس اللحاء على نطاق واسع بسبب الآثار الاقتصادية على الأشجار 18،19، ولكن كانت الملاحظات السلوكية المباشرة للحشرات داخل مواد شجرة محدود 4. وعلاوة على ذلك، فإن المعارض التي شيدت من قبل خنافس اللحاء أصبحت موئلا لعدد لا يحصى من الأنواع. 11 أعداد هائلة من الفطريات 30، 3 البكتيريا، عث 10،21، 16،19 والديدان الخيطية جنبا إلى جنب مع غيرها من مفصليات الأرجل المفترسة والطفيلية 22،24 تسكن مادة اللحاء. التقنيات المقدمة هناالسماح للمراقبة المباشرة من الخنافس اللحاء، العث، والحفارون الخشب التي تعيش عادة في بيئات تحت القشرية. ويمكن إجراء تغييرات طفيفة على بروتوكول لدراسة الفطريات والبكتيريا.
وقد تم دراسة الخنافس النباح والكائنات الحية المرتبطة بها داخل الأنسجة شجرة باستخدام "شطيرة اللحاء." استخدام المبكر لهذه التقنية يمكن العثور عليها في الأدبيات التي يعود تاريخها إلى عام 1933، عندما كانت تستخدم لمراقبة الأعمار اليرقية للخنفساء دوغلاس التنوب (Dendroctonus pseudotsugae). 2 وقد ذهبت شطيرة اللحاء من خلال العديد من الاشتقاقات كما أصبحت المواد المختلفة المتاحة. في الأصل، يتألف هذا الجهاز من قطعة من اللحاء وضعها بين لوحين من الزجاج، والضغط معا عن طريق أربطة مرنة. 2 وفي وقت لاحق، وقد تم استخدام المشابك، والشريط، الغراء، والبلاستيك، وغيرها من المواد في بناء شطيرة 13،14. ، 15،17،26،28 بروتوكول الموصوفة هنا يوفر تحسينات على بعض التصاميم السابقة. على سبيل المثال، فيفي الماضي، تم إدخال أنواع الاختبار إلى جانب شطيرة، بين لوحات من الزجاج أو البلاستيك. يقتصر هذا على بناء صالات عرض لاتجاه واحد. استخدام فتحات دخول في الصفيحة العلوية يتيح حرية أكبر للأنواع الاختبار لبدء البناء معرض الطبيعي. ميزة أخرى لبروتوكول المعروضة هي تصميمها المبسط، والتي يمكن بناؤها بسهولة مع قليل من الأدوات. وقد سمح استخدام شطيرة اللحاء لالملاحظات المباشرة لسلوك التغذية والتكاثر والتطور، والتفاعل بين الكائنات الحية التي لولاها لم يكن ممكنا. 1،5، 22 وهذا الأسلوب هو أيضا أداة ممتازة لK-12 التعليم والعلوم البرامج والعروض.
هناك العديد من الخفايا في خلق شطيرة اللحاء التي يصعب تفسيرها أو من لم يبلغ عنها في المخطوطات. نحن نعتقد أن هناك حاجة ل(أي الفيديو) وصف المرئي للإنتاج شطيرة اللحاء وسيكونمن قيمة العلماء والمربين المهتمين بدراسة الكائنات الحية phloeophagous. وينص بروتوكول لدينا طريقة بسيطة وغير مكلفة لمراقبة المفصليات، الميكروبات، والكائنات الحية الأخرى التي تعيش أنسجة اللحاء.
Protocol
Representative Results
Discussion
شطيرة اللحاء يسمح لإدخال والمراقبة من المفصليات، الميكروبات، والكائنات الحية الصغيرة الأخرى التي تعيش في أنسجة اللحاء. 1،7،8،9،17،18 وقد أدى هذا الأسلوب في الاكتشافات الجديدة وفهم أفضل للسلوك، احلياة الصفات التاريخ، والتنمية، والتفاعلات بين الكائنات الحية داخل اللحاء الشجرة. 1،5،10 وصف بروتوكول شطيرة هنا هو مزيج من التصاميم السابقة، وسيوفر شطيرة الاقتصادية التي يتم بناؤها بسهولة مع الحد الأدنى من المعدات والمواد. يمكن إعادة استخدام قطع الزجاج، والاكريليك أو البولي، والمواد الاستهلاكية الوحيدة هي بارافيلم واللحاء.
على الرغم من كل الخطوات في بروتوكول مهمة، ينبغي اتباع خطوات معينة بدقة لضمان أعلى درجة من النجاح. أولا، شجرة يجب أن يكون موجودا لديه جزء من بولي حرة أو حرة نسبيا، والفروع. أشجار التي لها فروع كثيرة يصعب حلاقة وسوف ذبضع قطع اللحاء قابلة للحياة درع، كما يجب أن تقطع كل فرع في جميع أنحاء عند إزالة اللحاء. بعد ذلك، فمن المهم لتقليل التعرض الهواء من اللحاء. نضع كل قطعة بسرعة اللحاء في كيس على إزالة. مرة واحدة تتم إزالة 3-6 قطعة، ويتم نقلها في حقيبة مختومة فراغ. نستخدم السلطة العاكس لتشغيل سداده قبالة بطارية السيارة في هذا المجال. أخيرا، التعقيم وقطع الاكريليك والنظافة العامة عند تنفيذ هذا البروتوكول سوف يقلل نمو الفطريات في شطيرة. هذا مهم بشكل خاص للملاحظات الموسعة.
كما ذكر أعلاه، هناك قيود من الجهاز شطيرة اللحاء. منذ طبقة اللحاء رقيقة، ويمكن إدخال الكائنات الصغيرة فقط التي تبقى عادة في اللحاء في شطيرة. الحشرات الكبيرة مثل الحفارون الخشب (أي Buprestid والأنواع Cerambycid) يمكن إدخال ويلاحظ في المراحل المبكرة من دورة حياتها. هذا الإطار الزمني عادة ما يقتصر على اثنين لثلاثة أسابيع. بعد هذه النقطة اليرقات تتطلب الخشب الخشب إلى تجويف في لالتشرنق. في المقابل، لخنافس اللحاء، وخاصة تلك الموجودة في جنس IPS، دورة حياة كاملة يمكن ملاحظتها، بما في ذلك التزاوج والبيض فقس، والتغذية، pupating، وeclosion إلى خنفساء الكبار. في هذه المرحلة، وعادة ما استنفدت جدوى من الساندويتش بسبب جفاف ونمو الفطريات. 28 وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا الجهاز لا يسمح للحشرات بحرية وبشكل طبيعي استعمار أو الخروج من شطيرة اللحاء. 27
بروتوكول لدينا هو المرونة من حيث الحجم والشكل ونوع من اللحاء المستخدمة. دراسات قصيرة وتتطلب كمية أقل من مادة اللحاء وحجم شطيرة يمكن تحجيمها وفقا لذلك. وقد استخدمت العديد من الأنواع الصنوبرية الجهات المانحة اللحاء في شطيرة اللحاء (مثل الصنوبر الثقيل 12، دوغلاس التنوب 2، 29 شجرة التنوب، والصنوبر الأرض الطينية 27، longleaf الصنوبر 27). كما يمكن تغيير المواد في شطيرة. لالسابقينوافرة، لوحات زجاجية يمكن استخدامها بدلا من الاكريليك والايبوكسي أو الشريط بدلا من بارافيلم.
أصعب جزء من هذا البروتوكول هو عملية إزالة اللحاء. الأشجار بجانب بعضها البعض قد تختلف في مدى صعوبة اللحاء منها هو إزالة. عند شجرة لها اللحاء صعبا، والصبر أمر بالغ الأهمية. في هذه الحالات، تشغيل بعناية سكينا بين الخشب الصلب واللحاء الاسفنجية. هذه العملية يشعر حرفيا مثل السلخ الشجرة.
بعد اتقان هذه التقنية شطيرة الأساسية، ويمكن تعديلات على بروتوكول تساعد تناسب الاحتياجات المحددة. على سبيل المثال، من خلال شحذ التقنيات اللازمة لإزالة اللحاء، أكبر قطعة يمكن إزالتها واستخدامه لإنشاء السندويشات أكبر. أيضا، يمكن إجراء تعديلات على استيعاب صكوك محددة، على سبيل المثال، ثقوب إضافية لرصد الانبعاثات الكيميائية (الشكل 3A)، أو سجل أو تشغيل الأصوات (الشكل 3B). ويمكن إجراء تعديلات للسماح للحفاظ شبه دائم من اللحاء وجهازهاالمذهبين، أو الملاحظات مؤقتة من الكائنات الحية التي يمكن أن تسمح لاحقا مجانا.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Eli Jensen, Stefano Padilla, and Kasey Yturralde for assistance, and Karen London and anonymous reviewers of the manuscript. We thank Jake Baker and Karla Torres for video footage. Funding was provided to R.W.H by the NAU School of Forestry and NAU Technology and Research Initiative Fund (TRIF).
Materials
| Draw blade | Big Horn Brand | 20265 | 11” blade |
| Fillet Knife | American Angler | 30530 | 9” blade |
| Polycarbonate | Nexan | GE-33 | 0.093 in. thickness |
| Parafilm M | Fisher Scientific | S37441 | 2” wide |
| Clamps | Pony Jaw Opening | 3201-HT-K | 4” x 1” |
| Vacuum Sealer | FoodSaver | V2840, | VacLoc vacuum |
| and bags | FSFSBF0742-015 | bags in rolls |
References
- Aukema, B. H., Raffa, K. F. Behavior of adult and larval Platysoma cylindrical. (Coleoptera: Histeridae) and larval Medetera bistriata. (Diptera: Dolichopodidae) during subcortical predation of Ips pini (Coleoptera: Scolytidae). J Insect Behav. 17, 115-128 (2004).
- Bedard, W. D. The number of larval instars and the appropriate length of the larval stadia of Dendroctonus pseudotsugae. Hopk., with a method for their determination in relation to other bark beetle. J Econ Entomol. 26, 128-134 (1933).
- Bridges, J. R. Nitrogen-fixing bacteria associated with bark beetles. Microb Ecol. 7, 131-137 (1981).
- Cardoza, Y. J., Klepzig, K. D., Raffa, K. F. Bacteria in oral secretions of an endophytic insect inhibit antagonistic fungi. Ecol Entomol. 31, 636-635 (2006).
- Cardoza, Y. J., Moser, J. C., Klepzig, K. D., Raffa, K. F. Multipartite symbioses among fungi, mites, nematodes, and the spruce beetle, Dendroctonus rufipennis. Environ Entomol. 37, 956-963 (2008).
- Chen, H. -. F., Salcedo, C., Sun, J. -. H. Male mate choice by chemical cues leads to higher reproductive success in a bark beetle. Animal Behavior. 83, 421-427 (2012).
- Dodds, K. J., Graber, C., Stephen, F. M. Facultative intra guild predation by larval Cerambycidae (Coleoptera) on bark beetle larvae (Coleoptera: Scolytidae). Environmental Entomology. 30, 17-22 (2001).
- Franklin, R. T. A technique for studying the insect parasites of Dendroctonus frontalis. and other bark beetles (Coleoptera: Scolytidae). Journal of Georgia Entomology Society. 2, 43-44 (1967).
- Gries, G., Pierce, H. D., Lindgren, B. S., Borden, J. H. New techniques for capturing and analyzing semiochemicals for Scolytid beetles (Coleoptera: Scolytidae). J Econ Entomol. 81, 1715-1720 (1988).
- Hofstetter, R. W., Moser, J. C., McGuire, R. Observations of the mite Schizosthetus lyriformis. (Acari: Parasitidae) preying on bark beetle eggs and larvae. Entomology. News. 120, 397-400 (2009).
- Hofstetter, R. W., Klepzig, K. D., Coulson, R. Chapter 11: Mutualists and Phoronts of the Southern Pine Beetle. United States Dept. of Agriculture Forest Service, Southern Research Station General Technical Report SRS-140. , 161-181 (2011).
- Hofstetter, R. W., Dunn, D. D., McGuire, R., Potter, K. A. Using acoustic technology to reduce bark beetle reproduction). Pest Manag Sci. 70, 24-27 (2014).
- Hopping, G. R. Techniques for rearing Ips. De Geer (Coleoptera: Scolytidae). Can Entomol. 93, 1050-1063 (1961).
- Hougardy, E., Gregoire, J. -. C. Cleptoparasitism increases the host finding ability of a polyphagous parasitoid species, Rhopalicus tutela (Hymenoptera: Pteromalidae). Behav Ecol Sociobiol. 55, 184-189 (2003).
- Kaston, B. J., Riggs, D. S. Studies on the larvae of the native elm bark beetle. J Econ Entomol. 30, 98-108 (1937).
- Kinn, D. N. Life cycle of Dendrolaelaps neodisetus. (Mesostigmata: Digamasellidae), a nematophagous mite associated with pine bark beetles (Coleoptera: Scolytidae). Environ Entomol. 13, 1141-1144 (1984).
- Kinn, D. N., Miller, M. C. A phloem sandwich unit for observing bark beetles, associated predators, and parasites. USDA FS Res. Notes SO-269. , 3 (1981).
- Lieutier, F., Day, K. R., Battisti, A., Gregoire, J. -. C., Evans, H. F. . Bark and wood boring insects in living trees in Europe, a synthesis. , 569 (2004).
- Massey, C. L. The influence of nematode parasites and associates on bark beetles in the United States. Bulletin of the Entomology Society of America. 12, 384-386 (1966).
- Moser, J. C., Roton, L. M. Mites associated with southern pine bark beetles in. Allen Parish, Louisiana. Can Entomol. 103, 1775-1798 (1971).
- Mills, N. J. The natural enemies of scolytids infesting conifer bark in Europe in relation to the biological control of Dendroctonus. spp in Canada. Biocontrol News Information. 4, 305-328 (1983).
- Nagel, W. P., Fitzgerald, T. D. Medetera aldrichii. larval feeding behavior and prey consumption [Dipt.: Dolichopodidae]. Entomophaga. 20, 121-127 (1975).
- Paine, T., Raffa, K., Harrington, T. Interactions among scolytid bark beetles, their associated fungi, and live host conifers. Annu Rev Entomol. 42, 179-206 (1997).
- Reeve, J. D., Coulson, R. N., Klepzig, K. D. Predators of the southern pine beetle. Southern Pine Beetle II. , 153-160 .
- Reid, R. W. The behavior of the mountain pine beetle, Dendroctonus monticolae. Hopkins, during mating, egg laying and gallery construction. Can Entomol. 90, 505-509 (1958).
- Taylor, A. D., Hayes, J. L., Roton, L., Moser, J. C. A phloem sandwich allowing attack and colonization by bark beetles (Coleoptera: Scolytidae) and associates. J. Entomol. Soc. Amer. 27, 101-116 (1992).
- Yu, C. C., Tsao, C. H. Gallery construction and sexual behavior in the southern pine beetle, Dendroctonus frontalis. Zimm. (Coleoptera: Scolytidae). Georgia Entomology Society. 2, 95-98 (1967).
- Yturralde, K. The Acoustic Ecology of Bark Beetles and Bed Bugs. PhD. Dissertation. , 323 (2013).
- Wermelinger, B., Seifert, M. Analysis of the temperature dependent development of the spruce bark beetle Ips typographus (L.) (Col., Scolytidae). Journal of Applied Entomology. 122, 185-191 (1998).
- Whitney, H. S., Mitton, J. B., Sturgeon, K. B. Relationships between bark beetles and symbiotic organisms. Bark Beetles in North American Conifers. , 183-211 (1982).
- Wood, S. L. The bark and ambrosia beetles of North and Central America (Coleoptera: Scolytidae), a taxonomic monograph. , 1359 (1982).
