Подготовка первичных нейронов для визуализации нейриты в Frozen-гидратной государства Использование крио-электронной томографии
Summary
Чтобы сохранить нейрональные процессы ультраструктурным анализа, мы опишем протокол для обшивки первичных нейронов по электронной микроскопии сеток с последующей флэш замораживания, получая образцы взвешенных в слое стекловидного льда. Эти образцы могут быть рассмотрены с крио-электронного микроскопа для визуализации структуры в нанометровом масштабе.
Abstract
Невриты, оба дендриты и аксоны, являются нейронные клеточные процессы, которые позволяют проведение электрических импульсов между нейронами. Определение структуры нейритах имеет решающее значение для понимания того, как эти процессы перемещения материалов и сигналов, которые поддерживают синаптическую связь. Электронная микроскопия (ЭМ) традиционно используется для оценки ультраструктурные особенности в рамках невриты, однако воздействие органического растворителя при дегидратации и смолы вложения могут исказить структур. Важным неудовлетворенная целью является разработка процедур, позволяющих структурных оценок не пострадавших от таких артефактов. Здесь мы создали подробную и воспроизводимый протокол для выращивания и флеш-замораживания целые нейриты различных первичных нейронов на электронной микроскопии сетей с последующим их рассмотрения с крио-электронной томографии (крио-ET). Эта техника позволяет 3-D визуализации замороженных гидратированных нейритах на нанометровым разрешением, облегчая Assessment их морфологических различий. Наш протокол дает беспрецедентный вид на спинной ганглий корень (DRG) невриты, а также визуализации гиппокампа нейритах в их почти родной государства. Как таковые, эти методы создают основу для будущих исследований по нейритах обеих нормальных нейронов и страдающих от неврологических расстройств.
Introduction
Нейроны установить сложных схем, необходимых для функции центральной и периферической нервной системы по разработке дендриты получать информацию и аксоны, часто довольно длительным, общаться с вниз по течению нейронов. Рост нейритов играет фундаментальную роль в процессе эмбрионального развития и дифференцировки нейронов и поддержания нейритах поддерживает критически функцию нервной системы. Нейритных процессы также имеют критически нейронов травмы и регенерации, а также нервной системы. Изучение нейронов архитектуры важно понять как нормальную и больного мозга. К счастью, физиологически соответствующие нейронные системы клеточных культур существуют, которые могут повторять сложные и гетерогенных клеточных структур. На основе выяснения твердых экспериментальных площадок, эффективных стратегий визуализации, которые позволяют качественный и количественный анализ нейронной морфологии необходимы. Особенно полезно будетбыть подробная методология, которая обеспечивает согласованную платформу для визуализации нейриты, как аксонов и дендритов в нанометровом масштабе.
Традиционный электронная микроскопия требует использования органического растворителя в процессе дегидратации и смолы вложения, которые могут вызывать искажения в образцах от их истинное положение. На сегодняшний день большинство структурные характеризации в нанометровом масштабе основаны на больших клеток или тканей, которые подвергаются таких агрессивных химикатов – таким образом, ограничивающих интерпретацию результатов 4,9,25. Кроме того, для проникновения электронного пучка, секционирование требуется для организмов или клеточных выступов, обладающих толщину большую, чем 1 мкм 12. Наконец, срезы или измельченный результаты тканей в набор дискретных срез конкретных наборов данных, что делает обременительным определение удлиненного элемента нейритов. Даже для крио-ЭМ, в котором секционирования с замороженными гашеной образец можно, метод вводит сжатия Artifдействует 1.
В последние годы исследователи научились выращивать гиппокампа нейронов непосредственно на развивающихся сетей и вспышкой замораживания их в жидком этана впоследствии визуализировать нейриты помощью крио-ET 8,10,18,23. Тем не менее, такие исследования или использовать на заказ устройство 10,23, или отсутствие детали на промокательной шага для создания достаточного тонкий стекловидный лед для рутинной визуализации 8,18. Например, в одном исследовании рекомендует использовать 30-40 сек для декантации EM сетки 10, однако это значение оптимизирован не для общего пользования, но является специфическим для этого заказного глубоководным заморозки устройства. Использование на заказ устройство, а не имеющийся в продаже один 17 для поддержания влажности до окунуться заморозки образца может создать препятствие для широкого воспроизводимости.
Хотя эти исследования были новаторским в визуализации нейриты на крио-ЭТ, мы взяли еще один шаг вперед, чтобы исследовать арприменимости из крио-ЭТ к различным нейронных образцов (гиппокампа и задних корешков ганглиев нейронов). Кроме того, мы рассмотрим оба оптимальные и неоптимальные результаты, а также потенциальные артефакты, которые можно было столкнуться с помощью крио-ET для таких образцов.
Определение подробную методику для сохранения и визуализации целые нейриты в нанометровом масштабе в почти родной государства должно расширить возможности для более исследователей осуществлять ультраструктурные исследования. С этой целью мы опишем эффективную и подробный протокол с использованием коммерчески доступного оборудования для подготовки нефиксированные, неокрашенные нейроны визуализировать нейриты. Это важный первый шаг к детализации ультраструктуры здоровых невриты и заложить основу для понимания того, что структурные различия присутствуют в моделях заболевание нервной системы. С крио-ЭТ может решить нефиксированные, неокрашенные особенности аксонов в 3-D в нанометровом масштабе, метод позволит как никогда бытьПоэтому, чтобы определить нейритных архитектуры 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы покажем, что крысы эмбриональных нейронов (спинной ганглий корень и гиппокампа) можно выращивать на золотом электронной микроскопии (ЭМ) сетках и замораживали в стекловидное льда достаточно тонкой для своих нейритах для включения в образ с помощью 2-D крио-ЭМ и 3-D крио- ET. В то время ка?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами NIH (PN2EY016525 и P41GM103832). СВС была поддержана стипендией от подготовки выпускников Программы нанобиологии междисциплинарных из Кека Центра междисциплинарных Bioscience подготовки побережье Мексиканского залива консорциумов (NIH грант № T32EB009379).
СВС рассеченные, рос и остеклованные DRG и клеток гиппокампа; собраны крио-ЭМ и крио-ET данные DRG и гиппокампа аксонов; реконструирован и цвет-аннотированный серию наклона. MRG расчлененный и при условии, гиппокампа клетки в лаборатории МПР в. SC помощь в наклона серии аннотации. СВС обучался CW о том, как анализировать и расти нейроны. СВС, WCM и туалет задуман эксперименты. СВС подготовили рукопись с участием других авторов.
Этот фильм был снят в Центре Cellular изображений и NanoAnalytics (С-CinA) от Biozentrum третон университет Базель. С-CINA интегрирован в Департамент биосистем науки и техники (D-BSSE) от ETH Zürich, расположенный в Базеле, Швейцария.
Materials
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Mini grid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semi-automated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
References
- Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
- Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer’s disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
- Binks, B. P. . Modern characterization methods of surfactant systems. , (1999).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).
- Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
- Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
- Garvalov, B. K., et al. Luminal particles within cellular microtubules. J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).
- Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
- Gu, J., Bourne, P. E. . Structural bioinformatics. , (2009).
- De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (1998).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
- Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
- Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
- Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson’s disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
- Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
- Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
- Medalia, O., et al. Organization of actin networks in intact filopodia. Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).
- Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).
- Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
- Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
- Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
- Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
- Squire, L. R. . Fundamental neuroscience. , (2003).
- Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
- Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. Neurosciences. 108, 493-506 (2001).
