从鼠标阻力动脉分离微血管内皮管

1。制备设备：流动室，移液器和解决方案流室：使用流室与底部24毫米×50毫米的玻璃盖玻片superfuse孤立的内皮管（ 见图1A）。前装配该室，与两个3％的HCl和70％的乙醇洗涤盖玻片，漂洗用超纯水，并用氮气干燥气体。 移液器：三种不同类型的移液器在协议期间使用：插管，研制，并钉扎。同时插管和钉扎移液器可以在实验的前一天进行，但研磨移液管应，因为它需要在容器的直径的知识，以大小的管腔适当的日子。 插管移液器：为了冲洗红细胞从管腔，使用微量拉马以己之长，较细的一端拉硼硅玻璃毛细管。中断与镊子的外径端部〜30％乐SS比动脉（〜50-80微米），以及火抛光笔尖光滑（参见图1B）。是有帮助的角度也将移液管的尖端至约45°。 研磨移液器：要机械地分离的平滑肌细胞和外膜的内皮管，由硼硅玻璃毛细管作研制过程移液器。制备毛细管如上，并打破端与钳。提示：使用玻璃刻痕装置，以使其更易于清洁破坏的磨碎玻璃移液管的较厚的壁。打破移液器上的实验中，约10-20微米比从其中内皮管将被隔离的容器的外径大的日子中确定的内直径。火抛光的断头，直到顺利（参见图1C）。 钢钉移液器：为稳定流室中的内皮管，使移液管钉来固定内皮吨宇部对着所述腔室的底部的盖玻片。拉玻璃毛细管中相同的方式作为插管移液器。然后断开与钳两端的直径约为100μm，而火抛光，直到提示是密封的，圆润光滑（ 见图1D）。注意：如果穿针吸管尖不完全密封，流​​体将进入腔和可能混淆实验结果。 解决方案：准备在超纯所有的解决方案（18.2MΩ）H 2 O和通过0.2微米的过滤消毒的。确保解决方案的渗透压为285-300毫渗量之间。解决方案保持良好的约两周贮存于4℃时， 剥离液：在腹壁上动脉的解剖过程中使用的盐溶液是由（以毫摩尔/升）：137氯化钠，氯化钾5，1的MgCl 2，10 N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（ HEPES），10葡萄糖，0.01硝普钠（SNP）的ð0.1％牛血清白蛋白（BSA），pH为7.4。 NO供体SNP包括帮助松弛平滑肌细胞，从而使他们更容易导管插入动脉和研磨过程中促进平滑肌细胞去除。 解离液：内皮管的解离过程中使用的盐溶液是由（以毫摩尔/升）：137氯化钠，氯化钾5，1的MgCl 2，10 HEPES，10葡萄糖，2的CaCl 2，和0.1％BSA，用的pH为7.4。以1毫升等分的该缓冲液中，添加：0.62毫克/毫升的木瓜蛋白酶，1.5毫克/毫升胶原酶和1.0毫克/毫升二硫赤藓醇。由于来自不同供应商的酶可以有不同的酶活性水平，包括在材料表中引用那些用于这项工作的产品编号。注：在协议双方分离缓冲液和分离缓冲液的酶是用来在不同的步骤。 表面灌流液：用于superfusin的生理盐溶液（PSS）克分离的内皮管是由（以毫摩尔/升）：137氯化钠，氯化钾5，1的MgCl 2，10 HEPES，10葡萄糖和2的CaCl 2，pH为7.4。 开始外科手术前准备缓冲区和解决方案。从4°C和等分加入50ml缓冲解剖取出溶液到200ml锥形瓶中并置于冰上。此外，分装50毫升解离缓冲无酶，并将其放置在台面上，以平衡至室温。从4℃取出灌流液，并使其平衡至室温在台面上。 2。动物的制备确保所有程序和协议，涉及动物是符合健康指南的国家研究院实验动物的护理和使用 。这里所描述的程序批准了大学的动物护理和使用委员会密苏里州。 使用雄性或雌性小鼠至少9周龄和独立研究每个。麻醉小鼠通过腹腔（IP）注射戊巴比妥钠（60毫克/千克）。提示：稀释的戊巴比妥至10毫克/毫升的无菌盐水注射前降低了过量的可能性。 麻醉前注射戊巴比妥后立即危及温度调节，所以保持鼠标温暖。上加热板（校准到〜37°C）的顶部采用了金属载体（通风铝篮）的作品很好地保持鼠标的温度稳定。或者，使用烤灯，小心的从鼠标适当的距离来定位它。监视鼠标每次5-10分钟，直到麻醉的适当水平达到（缺乏撤出到脚趾或尾巴捏）。的补充剂量后15-20分钟是必需的。最好是循序渐进，注意避免过量，特别是与肥胖，年龄，或动物S的方式强调。 通过小心地用小宠物电推剪剃它从腹侧取出头发。应特别注意注意避免外伤的动物。它有利于从一个地区跨越腋下到耻骨区中删除所有的头发。删除任何松散执着的头发用新鲜的酒精棉签。 放置在它的后面鼠标，躺在既脱颖而出，后肢散开，露出尽可能多的腹壁越好。如有必要，使用实验室的胶带沾住腿在一条传播鹰的方式。 3。在腹壁上动脉的分离通过皮肤只是丹田的区域的上方做一个小切口。确保只有皮肤，同时避免损坏底层腹部肌肉被切开;横向延伸在每个方向上的切口出到各自的后肢。继续切口吻侧沿腹侧中线到肋笼的顶部和n以每个方向横向延伸的切口，以各自的前肢。 轻轻提起皮肤并用剪刀切断结缔组织保持皮肤下面的肌肉，从而露出腹部肌肉的整个表面上（ 见图3A）。灌溉外露肌肉用室温0.9％的生理盐水溶液。 由于海水的体积小，放置动物体视显微镜作进一步的程序下方。抬起脂肪垫位于与钳胸骨的底部，并通过它使一个切口。继续沿着底部肋切口，确保不要剪得太深进入皮下组织。战略环评应该是可见的;小心，避免损坏。一旦切口完成后，灌溉用室温下0.9％的生理盐水溶液中的暴露组织。 后骨骼肌的顶层已经缩回，大海和下面的肌肉很容易识别。提示：请注意长度隔离延长内皮管（沿其轴线在隔离的缩短），接近其原始长度前海在体内 。使用镊子和剪刀，小心地切除爪哇下方的薄肌肉层。 使用倾斜的镊子，通过海下6-0丝线缝合的长度和结扎动脉及其邻近静脉，以保持它的加压和血液保留血管管腔内，以在后续的分离和清洗方便的可视化。 重复的海结扎程序上的对侧。 一旦双方的策略性已被结扎，使沿腹部肌肉分开各边的中线切口。 横向延伸的切口在每一个方向上进行的皮肤，然后继续切口垂直沿外边缘完全从主体分离的腹部肌肉。避免损伤血管的爪哇美联储维持加压管腔。 Ç用ut爪哇结扎以上，以保持密封，然后将分离的肌肉和血管中的50ml烧杯中含有10毫升4℃解剖缓冲区。 重复上述步骤，腹部的另一侧，并培育组织的解剖缓冲10分钟。 放置在冷藏（4℃）含夹层腔剥离缓冲液含有爪哇的腹肌（ 见图3B）。解剖腔由一个培养皿底部一层的Sylgard（聚二甲基硅氧烷[PDMS]）的。 用昆虫针（0.15 mm）的，舒展隔离爪哇和腹部的肌肉出近似体内的长度（如上所述），并将其固定到的Sylgard。提示：定向肌肉，从而面临腹膜薄层在顶部，使爪哇随时可见使用透。 利用精细显微切割工具及从结扎对上游现场工作下游终端，清除海从其配对静脉和周围组织，直到第一个主要分支站点（1-2厘米）。然后通过切割其正上方的分支站点和正下方的结扎切除大海。 要清除血液血管管腔内保留，导管插入大海，与冰冷的解剖缓冲冲洗。采用了一块硅橡胶管，附上吸管插管的后端到5毫升注射器含冰冷的解剖缓冲和固定微量的显微操作的夹层腔内放置其尖端导管插入大海。 一旦所有的红细胞被冲出，从插管吸管取出海，然后提起吸管出了夹层菜。 切海成较小的段，每段1-3毫米的长度。这些短段促进内皮管的隔离。 4。内皮管的隔离填补12毫米×75毫米的玻璃邪教URE管的中途与冰冷的解剖缓冲区。使用倾斜的镊子，转移动脉块放入培养管置于冰上。此时，结合消化酶与解离缓冲液1毫升中单独12毫米×75mm的培养管中的最终体积（见1.3.2解决方案）并预热该溶液至37℃加热块。 而分离缓冲液和酶正在升温，小心翼翼地从培养管含留下的血管段小体积吸解剖缓冲区。 轻轻地添加室温下解离缓冲无酶洗去剩余的剥离缓冲。提示：添加的解离缓冲缓慢，使得动脉件留在培养管的底部，以节省时间等待他们重新定居。提高缓冲温度超过从冰（4℃）多个步骤，以室温（〜24℃）至37℃，以减少震动。 小心吸了dissoc从培养管iation缓冲液，再次是一定要留下含有血管区段小体积。 取出预热解离缓冲液从加热块的酶，在加入1ml酶溶液转移至包含血管区段的培养管中，然后将培养管后面的加热块。在37°C为30分钟。 在用酶温育，准备研磨移液管，与矿物油回填它和将其固定在其被安装在一个显微微量调节。然后缩回微量柱塞，以填补吸管2 NL的分离缓冲液和枪头过流室位置。 在30分钟温育结束时，从加热块取出培养管中，小心地吸出缓冲如上。 用4ml室温下解离缓冲液冲洗动脉段。注意：它不再是必要的，以保持容器SEGM已废除在培养试管底部;干扰动脉件实际上有助于确保剩余的酶有效地除去。 转让一艘船段流室轻轻用1毫升微量吸它，并把它放入流室用1毫升分离缓冲液中。 利用含有微量的显微操作器，定位在研磨移液管的附近的血管段的一端的一角。 吸出血管区段（500 NL撤回）进入捣碎吸管慢慢（225升/秒），以便不引起机械应变的内皮细胞，然后将其弹出返回到腔室中。如果消化成功，平滑肌细胞和外膜将会从管内皮细胞解离。 重复研碎，直至所有的平滑肌细胞解离。要知道，过度研磨（4倍以上）会损坏内皮细胞，使它们反应迟钝激动剂。提示：使用移液管研碎，将外膜远离内皮管尽快，以防止它缠结的管。注意：使用移液管研碎，分离的内皮管可吸出并转移到一个单独的腔室中。 定位内皮管在中心的流动腔室的，沿流动方向对齐，并取出捣碎吸管。 在显微操作安全的钉扎移液器安装在所述流动室的任一端，并在内皮细胞管的相应端部定位自己的技巧。 降低一个钉扎吸管在管的一端连接到其按压在腔室的底部。位置以同样的方式，第二锁定吸管在所述管的另一端。注意：所述钉扎移液器位置是固定的管（它们放置在管的端部越远），并允许多个成像/实验区（将它们更接近该管的端部）之间的一个折衷。定位吨下摆〜从所述管的每个端部50μm的效果很好。正如钉扎吸管接触管，慢慢沿管的轴线缩回它，从而延长其近似体内长度，然后按下移液器针对该室底部，以确保所述管。 开始的灌流液的流动，并允许内皮管到休息至少20分钟，以平衡并附着（参见图3C）。使用蠕动泵跨内皮管保持恒定的流体流量（灌流）。注意：钢钉移液器可以一次内皮管附着在流量腔室的底部（〜25分钟）或留在适当位置，以确保内皮管变得不脱落除去。 5。染料加载和钙成像为了形象化细胞内钙离子反应，加载内皮管荧上午04时染料在室温（〜24℃）。停在洗澡流体流动，并添加荧光-4AM到10μM的终浓度在腔室中。等待10分钟，以使染料进入细胞，然后superfuse的内皮管的新鲜PSS 20分钟，以确保细胞外染料被除去，而细胞内的染料已完全脱酯化。 进行钙成像。对于这项工作，直立显微镜（参见图2）装备有一个旋转的圆盘共焦成像系统被用来在环境室温。用491 nm激光激发荧光钙染料和使用增强的数码相机采集图像（在500-550 nm发射）。