Isolatie van microvasculaire endotheelcellen Buizen van Mouse Resistance Arteries

1. Voorbereiding van de uitrusting: Flow Chamber, pipetten, en oplossingen Flow kamer: Gebruik een stromingskamer met een 24 mm x 50 mm glazen dekglaasje op de bodem om de geïsoleerde endotheliale buizen (zie figuur 1A) superfuse. Vóór de montage van de kamer, was de dekglaasjes met beide 3% HCl en 70% ethanol, spoelen met ultrapuur water, en droog met stikstofgas. Pipetten: Drie verschillende types van pipetten worden gebruikt tijdens het protocol: infusen, aanwrijven, en pinning. Zowel de infusen en pinning pipetten worden vóór de dag van het experiment, maar de tritureren tube moet de dag zoals vereist kennis van de diameter van het vat op maat het lumen wijze kunnen plaatsvinden. Canulatie pipetten: om rode bloedcellen te spoelen van het lumen, trek borosilicaatglas capillaire buizen met behulp van een micropipet trekker tot lange, taps toelopende uiteinden. Breek de uiteinden met een tang om een ​​buitendiameter ~ 30% less dan die van de slagaders (~ 50-80 micrometer), en vuur polijsten de tip glad zijn (zie figuur 1B). Het is nuttig om ook de hoek van de uiteinden van de pipetten tot ongeveer 45 °. Trituratie pipetten: mechanisch dissociëren de gladde spiercellen en adventitia van de endotheliale pijpen maken tritureren pipetten van borosilicaatglas capillaire buisjes. Bereid capillaire buisjes zoals hierboven, en breek het uiteinde met pincet. Tip: Gebruik een glazen scoresysteem om het gemakkelijker om de dikkere wand van de glazen pipet tritureren netjes breken. Breek de pipet aan de inwendige diameter bepaald op de dag van het experiment, ongeveer 10-20 urn groter dan de buitendiameter van het vat waaruit endotheliale buizen worden geïsoleerd. Fire polish de gebroken uiteinden tot een gladde massa (zie figuur 1C). Pinning pipetten: Om de endotheliale buis binnen de stromingskamer stabiliseren, maken pinning pipetten te beveiligen de endotheliale tUbe tegen de dekglaasje bodem van de kamer. Trek glazen capillaire buisjes op dezelfde wijze als de canule pipetten. Dan breken de uiteinden met een tang om een diameter van ~ 100 micrometer, en vuur polijsten tot de uiteinden zijn afgedicht, afgerond en glad (zie figuur 1D). Opmerking: als de punt van de pinning pipet wordt niet volledig afgesloten, zal vloeistof het lumen te voeren en kunnen experimentele resultaten verwarren. Oplossingen: Bereid alle oplossingen in ultrapuur (18.2 MQ) H 2 O en steriliseer ze door een 0,2 um filter. Zorg ervoor dat de osmolaliteit van de oplossingen is tussen 285-300 mOsm. Oplossingen blijven goed gedurende ongeveer twee weken indien bewaard bij 4 ° C. Dissection oplossing: De zoutoplossing tijdens de dissectie van de superieure epigastrische slagader bestaat uit (in mmol / L): 137 NaCl, 5 KCI, 1 MgCl2, 10 N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethaansulfonzuur ( HEPES), 10 glucose, 0,01 natriumnitroprusside (SNP), eend 0,1% runderserumalbumine (BSA) met een pH van 7,4. De NO donor SNP is opgenomen om te helpen ontspannen gladde spiercellen, waardoor ze makkelijker om de slagader canule en gladde spiercellen verwijdering gedurende fijnwrijving vergemakkelijken. Dissociatie oplossing: De zoutoplossing tijdens de dissociatie van de endotheliale buis bestaat uit (in mmol / L): 137 NaCl, 5 KCI, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose, 2 CaCl2 en 0,1% BSA, met een pH van 7,4. Een 1 ml van deze buffer, voeg: 0,62 mg / ml papaïne 1,5 mg / ml collagenase en 1,0 mg / ml dithioerythritol. Omdat enzymen van verschillende leveranciers verschillende niveaus van enzymatische activiteit hebben, worden de artikelnummers van die voor dit werk opgenomen als referentie in de tabel van materialen. Opmerking: Tijdens het protocol zowel dissociatie buffer en dissociatie buffer met enzymen worden op verschillende stappen. Superfusie oplossing: De fysiologische zoutoplossing (PSS) gebruikt voor superfusing de geïsoleerde endotheliale buis bestaat uit (in mmol / L): 137 NaCl, 5 KCI, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose en 2 CaCl2, met een pH van 7,4. Bereid buffers en oplossingen voor het begin van chirurgische procedures. Verwijder de oplossingen van 4 ° C en de hoeveelheid 50 ml van Dissection buffer in een 200 ml erlenmeyer en plaats het op het ijs. Daarnaast aliquot van 50 ml van dissociatie buffer zonder enzymen en plaats het op de bank top om op kamertemperatuur komen. Verwijder de superfusie oplossing van 4 ° C en laat het op kamertemperatuur op de bank top. 2. Bereiding van dieren Zorg ervoor dat alle procedures en protocollen met dieren zijn in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren. De hier beschreven procedures werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit vanMissouri. Gebruik mannelijke of vrouwelijke muizen ten minste 9 weken oud en studie elk afzonderlijk. Verdoven een muis met natriumpentobarbital (60 mg / kg) via de intraperitoneale (ip) injectie. Tip: Verdunning de pentobarbital 10 mg / ml in steriele zoutoplossing voor injectie vermindert de mogelijkheid van overdosering. Anesthesie compromissen temperatuurregeling, dus houd de muis warm onmiddellijk na de eerste injectie van pentobarbital. Met een metalen drager (geventileerd aluminium mand) op een verwarmingsplaat (gekalibreerd op ~ 37 ° C) werkt goed om de temperatuur van de muis stabiel. U kunt ook een warmtelamp, en zorg ervoor dat de stand op een geschikte afstand van de muis. Toezicht houden op de muis om de 5-10 min tot het juiste niveau van de anesthesie wordt bereikt (het ontbreken van terugtrekking tot teen of staart knijpen). Een aanvullende dosis kan nodig zijn na 15-20 minuten. Het beste is om langzaam en voorzichtig te werk gaan om overdosering te vermijden, vooral bij zwaarlijvige, leeftijd, of dierlijkes anders benadrukt. Verwijder het haar van de buikzijde door zorgvuldig te scheren met klein huisdier tondeuses. Bijzondere aandacht moet worden genomen om trauma aan het dier te voorkomen. Het is nuttig om alle haren uit een gebied verspreid over de oksels om de schaamstreek te verwijderen. Verwijder eventuele losjes vasthouden haar met een frisse alcoholdoekje. Plaats de muis op de rug liggen met zowel voor-en achterpoten gespreid om zoveel mogelijk van de buikwand mogelijk bloot. Gebruik indien nodig laboratorium tape om de benen te beveiligen in een spread-eagle manier. 3. Isolatie van de Superior Epigastrische Artery Voeg een kleine incisie door de huid boven het gebied van de schaamstreek. Zorg ervoor dat alleen de huid wordt gesneden terwijl het vermijden van schade aan de onderliggende buikspier; uitbreiding van de incisie lateraal in elke richting te onderscheiden achterpoten. Verdere rostraal incisie langs de ventrale middellijn naar de top van de ribbenkast en den lateraal uitstrekken de incisie in elke richting om respectieve voorpoten. Til de huid met een schaar te verbreken het bindweefsel die de huid aan de onderliggende spieren, waardoor het gehele oppervlak van de buikspieren bloot (zie figuur 3A). Irrigeren de blootgestelde spier met kamertemperatuur 0,9% zoutoplossing. Vanwege de geringe omvang van de zee, op het dier onder een stereomicroscoop voor verdere procedures. Til het vet pad aan de onderkant van het borstbeen met een tang en een insnijding maken doorheen. Blijven de incisie langs de onderste rib en zorg ervoor niet te diep te snijden in het onderliggende weefsel. De SEA moet zichtbaar zijn; zorg om beschadiging te voorkomen. Zodra de incisie is voltooid, irrigeren de blootgestelde weefsel met kamertemperatuur 0,9% zoutoplossing. Na teruggetrokken is de bovenste laag van de skeletspieren, worden de SEA en de onderliggende spier gemakkelijk te herkennen. Tip: Let op de lengte vande SEA in vivo voor het isoleren van endotheliale buizen (die verkorten langs hun as na isolatie) uit te breiden tot hun oorspronkelijke lengte benaderen. Met behulp van een tang en schaar, accijnzen zorgvuldig de dunne spierlaag onder de SEA. Met behulp van schuine pincet, langs een lengte van 6-0 zijden hechtdraad onder de SEA en afbinden van de slagader en de aangrenzende ader om het onder druk en bloed vastgehouden binnen het lumen van het vat te visualisatie tijdens de daaropvolgende isolatie en het schoonmaken te vergemakkelijken houden. Herhaal de SEA ligatie procedure aan de contralaterale zijde. Zodra beide SEA zijn geligeerd, maken een incisie langs de middellijn van de buikspieren aan de respectievelijke zijden scheiden. Verleng de incisie lateraal in elke richting zoals voor de huid, dan blijven de incisie verticaal langs de buitenkant volledig scheiden van de buikspier uit het lichaam. Voorkom schade aan het vaatstelsel gevoed door de zee naar het lumen onder druk te handhaven. Cut de SEA boven de ligatie om de afdichting te behouden en plaats de geïsoleerde spier en slagader in een bekerglas van 50 ml die 10 ml 4 ° C dissectie buffer. Herhaal deze procedure voor de andere kant van de buik en incubeer de weefsels in de dissectie buffer gedurende 10 minuten. Plaats de buikspier met de zee in een gekoelde (4 ° C) dissectie cupje met dissectie buffer (zie figuur 3B). De ontleding kamer bestaat uit een petrischaal met een laag Sylgard (polydimethylsiloxaan [PDMS]) onderaan. Met behulp insect pinnen (0,15 mm), strek de geïsoleerde SEA en buikspier aan in vivo lengtes (hierboven vermeld) benaderen en bevestig deze aan de Sylgard. Tip: Oriënteren de spier zodanig dat de dunne laag tegenover het buikvlies is op de top maakt het SEA gemakkelijk zichtbaar met behulp transillumination. Gebruik te maken van fijne microdissection instrumenten en werken vanuit de stroomopwaartse plaats van de eileiders naar destroomafwaartse einde, schakelt de zee vanaf het gepaarde ader en het omliggende weefsel tot de eerste grote filiaalsite (1-2 cm). Accijnzen dan de zee door te snijden net boven de filiaalsite en net onder de ligatie. Om bloed vastgehouden binnen het lumen van het vat te verwijderen, canule de zee en spoelen met ijskoud dissectie buffer. Met behulp van een stuk van flexibele buizen, bevestigt u de back-end van een cannulatie pipet een 5 ml spuit met ijskoude dissectie buffer en zet de micropipet in een micromanipulator om de punt te positioneren binnen de dissectie kamer naar de SEA canule. Zodra alle van de erytrocyten worden gespoeld, verwijder de SEA van de infusen pipet, en til de pipet uit de dissectie schotel. Snijd de SEA in kleinere segmenten elke 1-3 mm in lengte. Deze kortere segmenten vergemakkelijkt het isoleren van endotheliale buizen. 4. Isolatie van de endotheliale Tube Vul een 12 mm x 75 mm glas culture buis halverwege met ijskoud dissectie buffer. Met behulp van gebogen tang, overdracht van de arteriële stukken in de cultuur buis en plaats op ijs. Op dit moment, combineren de spijsverteringsenzymen met dissociatie buffer tot een eindvolume van 1 ml in een afzonderlijke 12 mm x 75 mm kweekbuis (zie 1.3.2 Solutions) en verwarm de oplossing tot 37 ° C met een verwarmingsblok. Terwijl de dissociatie buffer en enzymen zijn warming-up, zorgvuldig aspireren de dissectie buffer van de cultuur buis verlaten van een klein volume met daarin de segmenten vat. Voeg zachtjes kamertemperatuur dissociatie buffer zonder enzymen weg te wassen overgebleven dissectie buffer. Tip: Voeg de dissociatie buffer langzaam zodat de arteriële stukken blijven op de bodem van de cultuurbuis om tijd wachten tot ze vestigen. Til de buffer temperatuur over meerdere stappen uit ijs (4 ° C), op kamertemperatuur (~ 24 ° C), tot 37 ° C om de schokken te minimaliseren. Zuig voorzichtig de dissociation buffer van de cultuur buis, opnieuw en zorg ervoor dat een klein volume met daarin de segmenten vaartuig te verlaten. Verwijder de voorverwarming dissociatie buffer met enzymen uit de verwarmingsblok, overdragen 1 ml enzymoplossing de cultuur buis met de segmenten vat en plaats de cultuurbuis weer het verwarmingsblok. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Tijdens de incubatie met enzymen, bereiden de tritureren pipet, opvulling met minerale olie en zet hem op een micro die in een micromanipulator is gemonteerd. Trekken dan de micro-zuiger om de pipet te vullen met 2 nl van dissociatie buffer en plaats de pipet tip over de stroom kamer. Aan het eind van de 30 min. incubatie, verwijder de cultuur buis uit het verwarmingsblok en zorgvuldig zuig de buffer als hierboven. Was de arteriële segmenten 4 ml kamertemperatuur dissociatie buffer. Opmerking: Het is niet meer nodig om het schip segm houdenouders onderaan de cultuurbuis, verstoren de arteriële stukken daadwerkelijk helpt te waarborgen dat resterende enzymen effectief worden verwijderd. Overdracht een vaartuig segment de stroom kamer voorzichtig opzuigen met een 1 ml micropipet, en plaats deze in de stroom kamer met 1 ml van de dissociatie buffer. Gebruik makend van de micromanipulator met de injectiespuit, plaats de punt van de pipet aanwrijving nabij een uiteinde van het segment vaartuig. Zuig het vaartuig segment (500 nl teruggetrokken) in de tritureren pipet langzaam (225 nl / s), zodat er geen mechanische belasting veroorzaken aan de EC en uitwerpen terug in de kamer. Als de spijsvertering succesvol was, zal de gladde spiercellen en adventitia los worden gezien van de endotheliale buis. Herhaal de aanwrijving totdat alle gladde spiercellen kunnen worden gescheiden. Wees ervan bewust dat overmatig wrijven (4x of meer) van de EC kan beschadigen en ze niet reageren op agonisten maken. Tip:met behulp van de tritureren pipet, verplaats de adventitia weg van de endotheliale tube zo snel mogelijk om te voorkomen dat verstrikken de buis. Opmerking: Het gebruik van de tritureren pipet, kan de geïsoleerde endotheliale buis worden opgezogen en overgebracht naar een aparte kamer. Plaats de endotheliale buis in het midden van de stromingskamer, uitgelijnd langs de stromingsrichting, en verwijder het fijnwrijven pipet. Veilig pinning pipetten op micromanipulators gemonteerd aan weerszijden van de stromingskamer en plaats de uiteinden bij respectieve einden van de endotheliale buis. Laat een pinning pipet op een uiteinde van de buis te drukken tegen de bodem van de kamer. Plaats de tweede pinning pipet op dezelfde wijze aan het andere uiteinde van de buis. Opmerking: als de pinning pipetten is een afweging tussen het vastzetten van de buis (door ze verder van het uiteinde van de buis) en waardoor meer beeldvorming / experimentele omgeving (door ze dichter bij het einde van de buis). Lokaliseren tzoom ~ 50 micrometer van elk uiteinde van de buis werkt goed. Zoals de pinning pipet raakt de buis langzaam uitlopen en langs de as van de buis, waardoor het verlenging van de in vivo lengte aangepast; druk de pipet tegen de kamer beneden naar fixeren. Begin de stroom van superfusie oplossing en laat de endotheliale buis vervolgens gedurende ten minste 20 minuten in evenwicht komen en zich (zie figuur 3C). Maken gebruik van een peristaltische pomp om een ​​constante vloeistofstroom (superfusie) over de endotheliale buis handhaven. Opmerking: Pinnen pipetten kan worden verwijderd zodra het endotheel buis gehecht aan de bodem van de stromingskamer (~ 25 minuten) of links getroffen om de endotheliale buis niet verdreven wordt. 5. Dye laden en Calcium Imaging Om intracellulair calcium reacties te visualiseren, laadt de endotheliale buis met fluo-04:00 kleurstof bij kamertemperatuur (~ 24 ° C). Stop vloeistofstroom in het bad, en voeg fluo-4AM de kamer bij een eindconcentratie van 10 uM. Wacht 10 minuten zodat de kleurstof om cellen in te voeren en superfuse de endotheliale buis met verse PSS 20 min om te zorgen extracellulaire kleurstof wordt verwijderd en dat intracellulaire kleurstof is volledig gedeësterificeerd. Voer calcium beeldvorming. Voor dit werk, een rechtopstaande microscoop (zie figuur 2) met een draaiende schijf confocale beeldvorming werd gebruikt bij omgevingstemperatuur. Prikkelen de fluorescerende calcium kleurstof met een 491 nm laser en het verwerven van beelden (bij 500-550 nm emissie) met behulp van een intensievere digitale camera.