Medlemmar av Burkholderia släktet är patogener av klinisk betydelse. Vi beskriver ett förfarande för att totalt bakteriellt protein extraktion, med användning av mekanisk sönderdelning och 2-D-gelelektrofores för efterföljande proteomic analys.
Undersökningen av de intracellulära proteinnivåer av bakteriearter är av betydelse för att förstå sjukdomsframkallande mekanismerna på sjukdomar orsakade av dessa organismer. Här beskriver vi ett förfarande för proteinutvinning från Burkholderia arter baserat på mekanisk lys med användning av glaspärlor i närvaro av etylendiamintetraättiksyra och fenylmetylsulfonylfluorid i fosfatbuffrad saltlösning. Denna metod kan användas för olika Burkholderia arter, för olika tillväxtbetingelser, och det är sannolikt lämplig för användning i proteomic studier av andra bakterier. Efter proteinutvinning, är en tvådimensionell (2-D) gelelektrofores proteomik beskrivna tekniken för att studera globala förändringar i proteom av dessa organismer. Denna metod består av separation av proteiner i enlighet med deras isoelektriska punkten genom isoelektrisk fokusering i den första dimensionen, följt av separation på basis av molekylviktgenom akrylamid gelelektrofores i den andra dimensionen. Visualisering av separerade proteiner utföres genom silverfärgning.
Släktet Burkholderia består av mer än 62 arter, gramnegativa organismer som isolerats från en mängd olika nischer, och den är uppdelad i två huvudsakliga grupper 1,2. Det första klustret ingår människa, djur och phytotrophic organismer, och de flesta studier har fokuserat på de patogena arterna i denna grupp på grund av deras kliniska betydelse. De mest patogena medlemmar är B. pseudomallei och B. mallei (som orsakar melioidosis och rots respektive) 3,4 och opportunistiska patogener (de 17 definierade arter av Burkholderia cepacia komplexa, BCC) 5, som orsakar sjukdom hos cystisk fibros (CF) och kronisk granulomatös sjukdom (CGD) 1. Det andra området, med mer än 30 icke-patogena arter, innehåller bakterier som följer med växter eller med miljön, och anses fördelaktigt för värden 2.
Många komplikationer uppstå frOM-bakteriell infektion med patogena medlemmar av Burkholderia släktet, såsom överföring av patogenen mellan patienter, spridning av sjukdomen och behandlingssvikt på grund av den inneboende eller förvärvad resistens mot antibiotika gör hårt för att utrota i de flesta fall 6-9. Därför få en tydligare förståelse för grunden för etablering av bakteriell infektion är avgörande för behandling av sjukdomar orsakade av dessa organismer. För att få insikt i etableringen av infektionen, krävs omfattande undersökningar på de bakteriella komponenterna i samband med patogenes. Studier med fokus på proteomik analys av Burkholderia organismer med hjälp av proteomik metoder beskrivna proteiner som har varit inblandade i bakteriell patogenes samt förändringar i deras proteome profiler 10-16.
Protein extraktionsmetoder som använder ultraljudsbehandling och frys tinade cykler i lyseringsbuffert innehållande höga koncentration av urea, har tiourea i kombination med diskmedel och amfolyter tillämpats i Burkholderia proteomik studier 10-13. Trots att urea är ganska effektiv för proteindenaturering, kan det skapa en jämvikt i vattenlösning med ammonium isocyanat, som kan reagera med aminosyragrupper och därigenom bilda artefakter (karbamylering reaktion) 17. Därför rekommenderas det att inkludera bäraramfolyter, som fungerar som cyanatgrupper asätare och undvika temperaturer över 37 ° C 17. Vidare, för att förhindra kemiska störningar lysbuffert med protein kvantifiering samma lysbuffert kan användas för att generera standardkurvan, så att proven och standarder har samma bakgrund 10. Andra metoder omfattar användning av alkaliska buffertar och rengöringsmedel med värme inkubationsperioder 17,18, men dessa villkor kan medföra förändringar i proteomet och vissa tvättmedel är inte kompatibla med proteomics ansökan om inte efterföljande borttagning tvättmedel steg ingår 17,18.
Efter adekvat extraktion och kvantifiering, kan studeras globala proteinuttryck i varje enskilt protein med hjälp av proteomik metoder såsom tvådimensionell (2-D) gelelektrofores. Denna teknik beskrevs först av O'Farell 19 och består i separation av proteiner i enlighet med deras isoelektriska punkten genom isoelektrisk fokusering i den första dimensionen, och sedan beroende på deras molekylvikt genom akrylamid gelelektrofores i den andra dimensionen. På grund av dess upplösning och känslighet, är denna teknik ett kraftfullt verktyg för att analysera och upptäcka proteiner från komplexa biologiska källor 19,20. Denna separationsteknik är för närvarande tillgänglig på protein-centrerad metoder med den stora fördelen av att lösa proteinisoformer orsakade av post-transkriptionella modifieringar eller proteolytisk bearbetning. Kvantitativa förändringarkan detekteras genom jämförelse med intensiteten hos den motsvarande fläcken efter färgning av gelén 20. Emellertid är denna teknik inte lämpar sig för identifiering av mycket stora proteiner, membranproteiner, extremt basiska och sura eller hydrofoba proteiner, och är en ganska arbetskrävande och tidskrävande teknik 20. Nya peptidcentrerade metoder (icke gel-baserade) som är mer robusta och objektiv blir tillgängliga och kan användas för kvantitativ jämförelse av differential stabil isotop märkningsmetoder såsom cystein märkning genom isotop-kodad affinitet taggning (ICAT) 21, och aminogrupp märkning genom isotopmärkning för relativ och absolut kvantifiering (iTRAQ) 22. Användningen av en enda proteomik teknik kan ge otillräcklig information, därför är nödvändigt att använda två kompletterande proteomik metoder för de flesta helt bedöma förändringar i proteome. Icke desto mindre är 2-D-gelelektrofores i stor utsträckning och kan tillämpas rutinmässigt för kvantitativa uttryck av flera proteiner i olika organismer.
Här beskriver vi en hel-cell protein utvinning och 2-D förfaranden gel elektrofores för Burkholderia arter som var anpassade och optimerade från GE Healthcare 2-D Elektrofores principer och metoder Handbook 80-6429-60AC 2004 ( www.amershambiosciences.com ). Extraktionen protein utfördes med användning av en vulst beater med glaspärlor i närvaro av PBS innehållande 5 mM EDTA (etylendiamintetraättiksyra) och 1 mM PMSF (fenylmetylsulfonylfluorid). Detta förfarande möjliggör kvantifiering av proteiner med minimal nedbrytning och kan ändras för proteomik metoder som tidigare rapporterats 15,23,24. 2-D gelelektrofores utfördes med användning av 24 cm långa immobiliserade pH 4-7 gradienten och proteinerna separerades enligt deras isoelektriska punkt. Då proteiner separerades enligt deras molecular vikt genom SDS-polyakrylamidgel. Dessutom har vi beskrivit en silverfärgningsmetod för visualisering av fläckproteiner och en silverfärgningsmetod som är kompatibel för masspektrometrianalys. Tillsammans dessa förfaranden kan möjliggöra identifiering av viktiga proteiner från Burkholderia arter som kan vara inblandade i patogenes.
Förfarande för proteiner framställning har beskrivits som kan extrahera de flesta av Burkholderia proteiner med god reproducerbarhet. Detta demonstreras genom att erhålla samma proteinprofilen från två oberoende beredningar som utförs på olika dagar med användning av samma bakteriekulturen odlades i LB eller YEM buljong såsom visas i fig. 1. Extraction var effektiv för bakterier som odlas i flytande medier, men vi har inte testat den här metoden för bakterier som odlas på plattor….
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av en student från University of British Columbia (BV) och bidrag från Cystisk Fibros Kanada och den kanadensiska Institutes of Health Research (till DPS). Vi tackar Jacqueline Chung för den inledande beredningen av protokoll.
Reagents | |||
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | Toxic, corrosive |
Acetone | Fisher | A18-1 | Flammable |
PBS Buffer | Bioscience | R028 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP118-500 | toxic |
Glass beads (0.1 mm) | BioSpec Products | 11079101 | |
Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) | VWR | 21009-342 | |
MicroBCA protein extraction kit | Pierce | 23235 | |
Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring | Fisher | 02-681-375 | |
2-D Clean-Up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
Urea | Invitrogen | 15505-050 | Irritant |
CHAPS | Amersham Biosciences | 17-1314-01 | |
Dithiothreitol (DTT) | MPBiomedical, LCC | 856126 | Irritant |
Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm | Amersham Biosciences | 176002-46 | |
Duracryl | Proteomic Solutions | 80-0148 | Very toxic, carcinogen |
Ammonium persulfate | Fisher | BP179-100 | Flammable, toxic, corrosive |
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Invitrogen | 15524-010 | Flammable |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Acute toxicity, flammable |
Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
Ethanol | Fisher | HC1100-1GL | Flammable, toxic |
Acetic acid | Fisher | A491-212 | Flammable, corrosive |
Glutaraldehyde | Fisher | G151-1 | Very toxic, corrosive, dangerous for the environment |
Potassium tetrathionate | Sigma | P2926 | Irritant |
Sodium acetate | EM Science | 7510 | |
Silver nitrate | Sigma | 209139 | Corrosive, dangerous for the environment |
Formaldehyde | Sigma | 252549 | Toxic |
Sodium thiosulfate | Sigma | S7026 | |
Tris Base | EMD | 9230 | |
Glycine | MPBiomedical, LCC | 808831 | |
Glycerol | MPBiomedical, LCC | 800688 | |
Methanol | Fisher | A412-4 | Flammable, toxic, health hazard |
Sodium carbonate anhydrous | EMD | SX0400-3 | Toxic |
Mineral oil | ACROS | 415080010 | |
Equipment | |||
JA-20 ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 334831 | |
Mini Beadbeater | Biospec Products | 3110BX | |
Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories | GE Healthcare | 80-6505-03 | www.amershambiosciences.com |
Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system | GE Healthcare | 80-6485-27 | www.amershambiosciences.com |