Total Protein Extraction och 2-D-gelelektrofores Metoder för<em> Burkholderia</em> Arter

Släktet Burkholderia består av mer än 62 arter, gramnegativa organismer som isolerats från en mängd olika nischer, och den är uppdelad i två huvudsakliga grupper ^1,2. Det första klustret ingår människa, djur och phytotrophic organismer, och de flesta studier har fokuserat på de patogena arterna i denna grupp på grund av deras kliniska betydelse. De mest patogena medlemmar är B. pseudomallei och B. mallei (som orsakar melioidosis och rots respektive) ^3,4 och opportunistiska patogener (de 17 definierade arter av Burkholderia cepacia komplexa, BCC) ^5, som orsakar sjukdom hos cystisk fibros (CF) och kronisk granulomatös sjukdom (CGD) ^1. Det andra området, med mer än 30 icke-patogena arter, innehåller bakterier som följer med växter eller med miljön, och anses fördelaktigt för värden ^2.

Många komplikationer uppstå frOM-bakteriell infektion med patogena medlemmar av Burkholderia släktet, såsom överföring av patogenen mellan patienter, spridning av sjukdomen och behandlingssvikt på grund av den inneboende eller förvärvad resistens mot antibiotika gör hårt för att utrota i de flesta fall ^6-9. Därför få en tydligare förståelse för grunden för etablering av bakteriell infektion är avgörande för behandling av sjukdomar orsakade av dessa organismer. För att få insikt i etableringen av infektionen, krävs omfattande undersökningar på de bakteriella komponenterna i samband med patogenes. Studier med fokus på proteomik analys av Burkholderia organismer med hjälp av proteomik metoder beskrivna proteiner som har varit inblandade i bakteriell patogenes samt förändringar i deras proteome profiler ^10-16.

Protein extraktionsmetoder som använder ultraljudsbehandling och frys tinade cykler i lyseringsbuffert innehållande höga koncentration av urea, har tiourea i kombination med diskmedel och amfolyter tillämpats i Burkholderia proteomik studier ^10-13. Trots att urea är ganska effektiv för proteindenaturering, kan det skapa en jämvikt i vattenlösning med ammonium isocyanat, som kan reagera med aminosyragrupper och därigenom bilda artefakter (karbamylering reaktion) ^17. Därför rekommenderas det att inkludera bäraramfolyter, som fungerar som cyanatgrupper asätare och undvika temperaturer över 37 ° C ^17. Vidare, för att förhindra kemiska störningar lysbuffert med protein kvantifiering samma lysbuffert kan användas för att generera standardkurvan, så att proven och standarder har samma bakgrund ^10. Andra metoder omfattar användning av alkaliska buffertar och rengöringsmedel med värme inkubationsperioder ^17,18, men dessa villkor kan medföra förändringar i proteomet och vissa tvättmedel är inte kompatibla med proteomics ansökan om inte efterföljande borttagning tvättmedel steg ingår ^17,18.

Efter adekvat extraktion och kvantifiering, kan studeras globala proteinuttryck i varje enskilt protein med hjälp av proteomik metoder såsom tvådimensionell (2-D) gelelektrofores. Denna teknik beskrevs först av O'Farell ¹⁹ och består i separation av proteiner i enlighet med deras isoelektriska punkten genom isoelektrisk fokusering i den första dimensionen, och sedan beroende på deras molekylvikt genom akrylamid gelelektrofores i den andra dimensionen. På grund av dess upplösning och känslighet, är denna teknik ett kraftfullt verktyg för att analysera och upptäcka proteiner från komplexa biologiska källor ^19,20. Denna separationsteknik är för närvarande tillgänglig på protein-centrerad metoder med den stora fördelen av att lösa proteinisoformer orsakade av post-transkriptionella modifieringar eller proteolytisk bearbetning. Kvantitativa förändringarkan detekteras genom jämförelse med intensiteten hos den motsvarande fläcken efter färgning av gelén ^20. Emellertid är denna teknik inte lämpar sig för identifiering av mycket stora proteiner, membranproteiner, extremt basiska och sura eller hydrofoba proteiner, och är en ganska arbetskrävande och tidskrävande teknik ^20. Nya peptidcentrerade metoder (icke gel-baserade) som är mer robusta och objektiv blir tillgängliga och kan användas för kvantitativ jämförelse av differential stabil isotop märkningsmetoder såsom cystein märkning genom isotop-kodad affinitet taggning (ICAT) ^21, och aminogrupp märkning genom isotopmärkning för relativ och absolut kvantifiering (iTRAQ) ^22. Användningen av en enda proteomik teknik kan ge otillräcklig information, därför är nödvändigt att använda två kompletterande proteomik metoder för de flesta helt bedöma förändringar i proteome. Icke desto mindre är 2-D-gelelektrofores i stor utsträckning och kan tillämpas rutinmässigt för kvantitativa uttryck av flera proteiner i olika organismer.

Här beskriver vi en hel-cell protein utvinning och 2-D förfaranden gel elektrofores för Burkholderia arter som var anpassade och optimerade från GE Healthcare 2-D Elektrofores principer och metoder Handbook 80-6429-60AC 2004 ( www.amershambiosciences.com ). Extraktionen protein utfördes med användning av en vulst beater med glaspärlor i närvaro av PBS innehållande 5 mM EDTA (etylendiamintetraättiksyra) och 1 mM PMSF (fenylmetylsulfonylfluorid). Detta förfarande möjliggör kvantifiering av proteiner med minimal nedbrytning och kan ändras för proteomik metoder som tidigare rapporterats ^15,23,24. 2-D gelelektrofores utfördes med användning av 24 cm långa immobiliserade pH 4-7 gradienten och proteinerna separerades enligt deras isoelektriska punkt. Då proteiner separerades enligt deras molecular vikt genom SDS-polyakrylamidgel. Dessutom har vi beskrivit en silverfärgningsmetod för visualisering av fläckproteiner och en silverfärgningsmetod som är kompatibel för masspektrometrianalys. Tillsammans dessa förfaranden kan möjliggöra identifiering av viktiga proteiner från Burkholderia arter som kan vara inblandade i patogenes.