Total protein Udvinding og 2-D gelelektroforese Metoder til<em> Burkholderia</em> Arter

Slægten Burkholderia omfatter mere end 62 arter, gram-negative organismer, der er isoleret fra en bred vifte af nicher, og det er opdelt i to hovedgrupper ^1,2. Den første klynge omfatter mennesker, dyr og phytotrophic organismer, og de fleste undersøgelser har fokuseret på de patogene arter af denne gruppe på grund af deres kliniske betydning. De mest patogene medlemmer er B. pseudomallei og B. mallei (der forårsager melioidosis og snive henholdsvis) ^3,4 og opportunistiske patogener (de 17 definerede arter af Burkholderia cepacia kompleks, BCC) ^5, som forårsager sygdom hos cystisk fibrose (CF) og kronisk granulomatøs sygdom (CGD) ^1.. Den anden klynge, med mere end 30 nonpathogenic arter inkluderer bakterier forbundet med planter eller med miljøet, og betragtes som potentielt gavnlig for værten ^2..

Talrige komplikationer dukke op frabout bakteriel infektion med patogene medlemmer af Burkholderia slægten, såsom transmission af patogenet mellem patienter, spredning af sygdommen og fiasko behandling på grund af den iboende eller erhvervet resistens over for antibiotika gør hårdt for at udrydde i de fleste tilfælde ^6-9. Derfor få en klarere forståelse af grundlaget for etablering af bakteriel infektion er afgørende for behandling af sygdomme forårsaget af disse organismer. For at få indblik i etableringen af ​​infektion, er der behov for omfattende undersøgelser på de bakterielle komponenter, der er forbundet med patogenese. Undersøgelser med fokus på proteom analyse af Burkholderia organismer ved hjælp af proteom tilgange beskrevet proteiner, der har været impliceret i bakteriel patogenese samt ændringer i deres proteom profiler ^10-16.

Proteinekstraktion metoder ved hjælp af lydbehandling og fryse-optøede cykler i lysis buffer indeholdende høj koncentration af urinstof, har thiourinstof i kombination med rengøringsmiddel og amfolytter blevet anvendt i Burkholderia proteom studier ^10-13. Selv om urinstof er ganske effektiv til proteindenaturering, kan det oprette en ligevægt i vandig opløsning med ammonium-isocyanat, der kan reagere med amino-grupper, hvorved der dannes artefakter (carbamylering reaktion) ^17. Derfor anbefales det, at bl.a. Carrier ampholytter, der fungerer som cyanat skraldemanden og undgå temperaturer over 37 ° C ^17. For at forebygge enhver kemisk interferens lysisbuffer med protein kvantificering samme lysisbuffer kan anvendes til at generere standardkurven, således at prøverne og standarderne har samme baggrund ^10. Andre metoder indebærer brug af alkaliske buffere og rengøringsmidler med varme inkubationsperioder ^17,18, men disse forhold kan fremkalde ændringer i proteom og nogle rengøringsmidler er ikke kompatible med PRoteomics ansøgning, medmindre efterfølgende trin vaskemiddel fjernelse indgår ^17,18.

Efter tilstrækkelig ekstraktion og kvantificering kan den globale protein udtryk enkelte protein blive undersøgt ved hjælp af proteom tilgange såsom todimensionale (2-D) gelelektroforese. Denne teknik blev først beskrevet af O'Farell ¹⁹ og består i adskillelse af proteiner i henhold til deres isoelektriske punkt ved isoelektrisk fokusering i den første dimension, og derefter i henhold til deres molekylvægt af acrylamid gel elektroforese i den anden dimension. På grund af sin opløsning og følsomhed, denne teknik er et kraftfuldt værktøj til analyse og påvisning af proteiner fra komplekse biologiske kilder ^19,20. Denne adskillelse teknik er i øjeblikket tilgængelig i protein-centreret tilgange med den store fordel at løse protein isoformer forårsaget af posttranskriptionel modifikationer eller proteolytisk forarbejdning. Kvantitative ændringerkan påvises ved at sammenligne intensiteten af den tilsvarende stedet efter farvning af gelen ^20. Imidlertid er denne teknik ikke egnet til identifikation af meget store proteiner, membranproteiner, yderst basiske og sure eller hydrofobe proteiner, og det er en noget besværlig og tidskrævende teknik ^20. Nye peptid-centreret tilgang (ikke gel-baseret), der er mere robust og mål bliver tilgængelige og kan anvendes til kvantitativ sammenligning af differentielle mærkning med stabile isotoper metoder såsom cystein mærkning af isotop-kodede affinitet tagging (ICAT) ^21, og aminogruppe mærkning af isotop tagging for relativ og absolut kvantificering (iTRAQ) ^22. Anvendelsen af ​​en enkelt proteomisk teknik kan give tilstrækkelige oplysninger, og derfor er det nødvendigt at anvende to komplementære proteom tilgange til de fleste fuldt ud at vurdere ændringer i proteomanalyse. Ikke desto mindre er 2-D gelelektroforese udbredte og kan rutinemæssigt anvendes til mængdertive ekspression af flere proteiner i forskellige organismer.

Her beskriver vi en hel-celle protein udvinding og 2-D gel elektroforese procedurerne for Burkholderia arter, der blev tilpasset og optimeret fra GE Healthcare 2-D elektroforese Principper og metoder Håndbog 80-6429-60AC 2004 ( www.amershambiosciences.com ). Proteinet Ekstraktionen blev udført ved anvendelse af en perle beater med glasperler i nærvær af PBS indeholdende 5 mM EDTA (ethylendiamintetraeddikesyre) og 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonylfluorid). Denne procedure giver mulighed for kvantificering af proteiner med minimal nedbrydning og er amendable for proteom tilgange som tidligere rapporteret ^15,23,24. 2-D gelelektroforese blev udført under anvendelse af 24 cm lange immobiliserede pH 4-7 gradient og proteiner blev adskilt i overensstemmelse med deres isoelektriske punkt. Derefter proteiner blev separeret efter deres Molecular vægt ved SDS-polyacrylamidgel. Derudover beskrev vi en sølvfarvning fremgangsmåde til visualisering af spot proteiner og en sølvfarve metode, der er kompatible til massespektrometrianalyse. Sammen disse procedurer kan føre til identifikation af vigtige proteiner fra Burkholderia arter, som kan være involveret i patogenesen.