薬物ターゲット相互作用と抗菌抵抗検出のナノメカニクス

これらの結果は、カンチレバーアレイセンサは、特に薬物の結合ポケットから単一のH-結合の欠失に関連付けられたバンコマイシン耐性の薬物標的結合相互作用の変化を検出し、定量化する感度を有することを示している。我々は、以前の表面プラズモン共鳴（SPR）研究と一致^18,19におけるバンのナノモルの検出感度を示し、日常臨床で適用されるカンチレバー法が直接臨床的に適切な濃度で血液中の薬物分子を検出および定量することができることを明らかにした。我々のデータは、すなわち （i）は、差動表面応力が製品形態の（1）式によって記述することができる特定の薬物標的結合事象を記述する化学的用語を示唆していると、（ii）幾何学的な用語は、化学的に反応させ間の機械的接続性を記述する表面部位、地元の化学的相互作用は、グローバルメカニッ​​クから切り離すことを意味するカンチレバーのらの相互作用。化学用語は、古典的なラングミュアの吸着等温式で与えられますが、幾何学的な用語は、薬物標的誘発表面応力変化のパーコレーションメカニズムを明らかにする。臨界しきい値PCは約10％（ 図5）は 、比較的大きな表面画分は抗生物質分子によって占有されているときに表面応力を一括して変換されることを示し、曲げ差動カンチレバーを検出する必要があった。ウェブについて≥パソコン、化学的形質転換表面部位との間の機械的接続が徐々に確立され、そのようなナノメカニカルネットワークのノード間の立体的相互作用などの短距離反発相互作用は全体カンチレバーが下方に屈曲増大を生じさせる。それは我々のナノメカニカルパーコレーションモデルが実際の細菌のアクションのグリコペプチド抗生物質モードにおいて重要な役割を果たしていることが推測される。これらの知見は、秒間カンチレバー技術の高感度を強調アクションの抗生物質 'モードをtudyingと超強力な感染症の問題を制御するための強力な薬物の発見を通知し、有効にするために、ナノスケールでの抗生物質の操作の理解を向上させるために薬を研究するための新たな研究ツールを表します。再現性と高感度測定用カンチレバーシステムを準備するには、我々は、特にマイクロ流体セルと定量的ナノメカニカル検出を可能にするための標準的な操作手順のサンプルローディングのため、プロトコルにおけるターゲットのセットに対処してきた。

既存の方法に関してカンチレバー技術の意義

要するに私たちは、この技術は25年以上前に提唱されたが、それがために医学的に関連したターゲットの慎重かつ反復的な測定値の不足のクリニックにその方法を見つけていないことを指摘。ここでは、メカニックを調査するためにナノメカニカルカンチレバーを使用することの妥当性を確立する手順を示していアルは、細菌の細胞壁のターゲットの抗生物質の影響力と抗菌抵抗を検出する。従来の薬物スクリーニング方法は、レポーター分子の蛍光または放射性標識のいくつかのタイプは、しばしば競争的または酵素結合アッセイおよびタンパク質アッセイ²⁰に関連して、その標的への検体の結合を測定することが必要である。生体分子の標識は、時間がかかり、高価ではないですが、ラベルには、偽陰性につながる、結合部位を妨害することによって分子間相互作用を妨害することができます。また、蛍光化合物は、多くの場合、バックグラウンドの結合と偽陽性につながることが疎水性である。これらの制限のために、実質的に任意の分子複合体は、最小限のアッセイの開発をスクリーニングすることができる新規な無標識技術の関心が高まっている。現時点で最も確立されたラベルフリー表面技術は、SPRと水晶振動子マイクロバランス（QCM）です。 SPRとは対照的に、そのメジャー番目電子誘電率、ラベルは – フリーカンチレバー技術は、直接表面受容体へのリガンドの特異的結合によって生成されたナノ機械力を測定することができるリガンド – 受容体相互作用によって発生する表面の歪みを検出する。これらのセンサの独自性は、技術が独自に勉強するのに適して作り、彼らの感度がSPRやQCMではなく、面内表面応力に足り誘発変化に関するような結合の検体に起因する質量変化による誘電特性に依存していないということです臨床的に適切な抗生物質の濃度の薬物分子のナノメカニクス^{（3-27μM）17。}カンチレバーも特によく主として製薬業界の基礎であるため、創薬における補完的なツールとなる複雑な環境を含む生理的条件下での小分子（例えば、DNAフラグメントおよび薬物など）の検出に適しています。カンチレバー技術が正常に適用されているゲノミクス^3,5の分野、ガスセンシング^21、プロテオミクス^22、および薬物^1。また、カンチレバーの微細加工プロセスと低コストのシリコン技術との互換性のためにを使用して製作され、カンチレバーは、複数の薬剤化合物のスクリーニングのためのセンサおよび高いスループット情報が豊富なスクリーニングアッセイの大きなアレイに改良された感度と並列化のために小型化することができる。計測機器や実験計画の改善は相互作用の多種多様な耐性感染多剤の問題に取り組むためsuperdrugs新世代のための検索を進めるのに役立つリアルタイムで分析できるようになります。

プロトコル内の重要なステップ

堅牢な測定プロトコルの開発は、この技術のアプリケーションの中心となります。良好な定量的薬物標的測定を達成するために、およびt抗生物質の最低濃度を決定する帽子は、プロトコル内の血清、重要なステップが対処されたバッファまたは血液中に検出することができた。最初のタスクは、チューニングおよびカンチレバー検出特異性および感度を高めるために、表面の化学的性質キャプチャを最適化することを含む。紛れもなく、表面応力伝達が化学反応領域間の接続を確立するために、被覆される表面の比較的大きな部分を必要とし、集合的な現象である。我々は、下にある表面ペプチドの密度、臨界閾値を変化させることによってウェブ ≥〜10％、判定されたことを示す場合にペプチド密度の関数とそうでなければゼロ（ 図5）のような表面応力スケール。それは実験敏感測定用信号の最大偏向を確保するために片持ち梁に沿った応力の均一性を調査するために設計されていることが重要である。また、効率的な表面リハビリプロトコルは、それによって複数のサイクル測定を可能にする、所定の位置になるように、各TESのコストを削減する必要がT。チオール化疎水性末端を使用して受容体表面の設計時に、それらの間の受容体分子と間隔の向きは、分子間のファンデルワールス相互作用に起因密充填物の自己集合は、非特異的な相互作用を最小限にできるようにすることが重要である。また、捕捉分子は、センシング行列の一部がコーティングされていない金表面と直接反応する検体溶液中の分子の挿入を防止するために親水性であることができるように、ポリエチレングリコール（PEG）リンカーを含むべきである。 PEGリンカー分子は、立体的制約を減らすため、液検体を測定可能な表面応力変化を誘導するために表面受容体と特異的に相互作用できるようにするスペーサとして機能しなければならない。カンチレバーアレイセンサは、 インサイチュ基準測定における少なくともアッセイで、リアルタイムで表示される信号は、差動偏向され、sから基準カンチレバーの絶対的な偏向を差し引くことによって得なければならないカンチレバーをensing。したがって、基準カンチレバーは、このような温度変化、屈折率やカンチレバーの非官能下側の相互作用の変化などの非特異的な相互作用を考慮するために不可欠です。それは、液体、溶液材料の十分な安定した大量輸送の効率的な交換を保証するため、流量の最適化（〜30〜150μL/分）プロトコルの中で重要なステップを形成する。液体セルの設計は速い流速に最適な音量（5-80μL）は、大量輸送の制限を克服するのに最適な液体交換を可能にするために許可する必要があります。運動の測定値^23を実行中に流量が特に重要である。大容量の液室は、不必要にアッセイの価格を増加させる大きなサンプルボリュームの要件につながる制御不可能な高流量を必要とする。以前に我々は、測定液室に異なる試料を注入する重力流を使用している。重力流は、それ雌利点を有するsが任意の機械的な部品を必要としないので、システムに追加のノイズを導入しません。しかしながら、重大な欠点は、比較的高流量（〜200μlの/分）で確実に動作することである。明らかに、より低い流量（≤を1μl/分）単位時間あたりの限られたサンプル容量を必要とするが、他方で、それは反応が非常に遅くなり、したがって、より長い接触時間が必要となる。それはサンプル溶液は実験中に消費されるにつれて減少する入口と出口との間の高さの差に依存するようさらに、重力流は、流量の大きな差異を有する。重力流の問題を回避するために、シリンジポンプを使用すべきである。シリンジポンプを使用する利点は、それが実験は全表示制御された環境で実現されることを可能時間の長い期間にわたって一定流量への換算を可能にすることである。

プロトコルの制限

再現性を得るための大きな課題カンチレバーセンサを用いdは、特定の生物学的検出は、受容層の特性は、生化学的に "アクティブ"にし、各アッセイに均一であることを保証することにある。実験的な成功の秘訣は、オリエント彼らのアクティブなコンフォメーションにおける受容体分子へリンカーをケミストリとの標準化されたクリーニングと固定化プロトコルでセンサーチップの注意深い前処理内にある。我々の現在の設定では、いくつかの欠点を受ける可能性があり、場合によっては問題となる可能性が小さいガラスキャピラリーを用いてカンチレバーアレイを官能。これらのガラスキャピラリー両方の両端で開いている、したがって、サンプル·溶媒は、容易に蒸発させるすることができます。官能化ステージの温度を正確に制御されていない場合は、蒸発速度は、エタノールのような揮発性溶媒を使用して、特に、異なる時間に著しく変化することができる。 1カンチレバーから別のgのインキュベーション時間のわずかな変化の可能性もありますセンシング液体が毛細血管に連続して読み込まなければならないことiven。キャピラリ官能の他の制限要因は、カンチレバーが常​​に正確に同じ方法で毛細血管内に挿入されることを保証する能力の欠如である。また、時にはカンチレバーは、液体試料がチップ本体上に流れることができるようにクロスコンタミネーションを防止するために、毛細血管から少し引き出されなければならない。我々は、被覆カンチレバーの代わりに表面コーティング手順のインクジェットスポッターを用いることによって、これらの問題を解決することができる。それは大規模な配列のためにスケールアップの可能性サンプルコーティングの正確な制御を可能にするだろうが、最も一般的な欠点は、カンチレバー上に堆積される小滴が数秒以内に蒸発することができるということですし、管理された湿度環境を必要とします。したがって、インキュベーション時間は、いくつかの用途にとって望ましいであるかもしれない、容易に調整することはできません。このようなサンプルVOなどの要因の微妙な相互作用LUME、インキュベーション時間及び蒸発速度は、官能試料とカンチレバーの露光に直接影響を与えるおよび受容体分子密度の任意の小さな変化がカンチレバーに大きな影響を持つようになる心配は、カンチレバーアッセイのために最適化された表面の化学的性質を保証するために注意しなければならない応答。

実験計画の変更（ すなわち 、代替技術や材料）

カンチレバー技術の将来の発展のための再現性のコーティング手順を取得する際に大きな課題を克服するために、異なった戦略がマイクロ流体チャネルに統合されたカンチレバーを使用することが必要である。アイデアは、その特別なカンチレバーチップがチャネルを個別にアドレス指定されるインサイチュ官能化手順でオンラインできるように、各カンチレバーは、独自のチャネル内に配置されるように設計されるべきである。これらの実験計画の変更は、コーティングプロセスが実行されることを可能にする溶媒への暴露を正確インキュベーション時間とカンチレバーチップ上の捕捉分子の固定化のための自動化された流量によって監視され制御された閉鎖環境におけるオピニオン。同一のチャネルは、すべてのカンチレバーは、同じ検体溶液にさらされる可能性があり、実際の結合実験を使用することができる。カンチレバー官能手順のほかに、カンチレバー読み出し機構はまた、改善が必要であろう。光ビーム偏向法は、非常に敏感であり、それは、長年にわたって、原子間力顕微鏡（AFM）技術において成功裏に使用されている。それにもかかわらず、自立カンチレバーセンサ用光学読み出しはいくつかの欠点を有し、例えばそれは、血液などの不透明な液体中の測定を許可しない、レーザの配列のアライメントは、時間がかかり、面倒であることができ、現在の構成では区別することはできません傾斜と垂直たわみ間。したがってcantilevの将来の発展ER技術は、一般的なセンサー設計（ 例えばカンチレバージオメトリ）と両方のフィールドと実験室環境での堅牢な測定プロトコルのカンチレバー読み出しの側面を考慮する必要があります。 Manalisおよび共同研究者^22は、デバイスは、高品質な因子と真空中で動作させることができるように、カンチレバービーム内に埋め込 ​​まれた流路を有する中空カンチレバーセンサの新規な種類を開発した。このモードでは、カンチレバーは、天秤²²として機能し、したがって、それは、典型的に自己組織化単分子層又はシランを用いて、このようにして捕捉分子を物理吸着することができ、または共有結合シリコン上に直接取り付けられ、官能に対して両側間の非対称性があることはもはや必要ではない^24。カンチレバーはまた、その後の生化学的検出のための抗体²⁵に結合される薄いポリマー層で変性することができる。

トラブルシューティング

一般的なプロカンチレバーの測定に関連付けられた傷は、マイクロ流体フローセル内に気泡の導入である。注意がチップを搭載しながら、気泡を液体細胞に導入されないように注意しなければならない。信号ドリフトはまた、サンプルの温度差に起因する別の一般的な問題です。カンチレバーは、測定が行われる前に安定させるために平衡化しなければなりません。すべてのバッファ、分析物及び再生ソリューションは、同じ温度を持つことがすべてのソリューションを可能にするためにカンチレバー楽器として同じ部屋に格納する必要があります。シリンジポンプは、非常に正確かつ極めて低い流量を提供することができるが、一般的には、カンチレバー測定における機械的なノイズと関連付けられる。これは、偏向信号中の不要なノイズを避けるために、簡単で効果的なノイズリデューサを考案することが重要である。ノイズリデューサは、シリンジポンプとtを吸収液体セルの間に位置する小さな液体リザーバから成りポンプから彼は機械的なノイズ。なぜなら、光検出器の敏感な性質のため、カンチレバー測定システムは、理想的には、光学読み出しシステムとの干渉からの迷光を遮断する密閉設定で動作されるべきである。洗浄工程は多数のセンサチップの寿命を制限するカンチレバー上で実行されている場合だけでなく、センシング層の品質が大幅に減少させることができる。

マスタリング後の代替または将来のアプリケーションこのテクニック

アミノ末端またはカルボキシル基で終端する自己組織化単分子層で被覆されたカンチレバーは、pHセンサーとして使用することができる。官能性末端基は、プロトン化または脱プロトン化溶液のpHに依存して^、24を曲げるカンチレバーをリード表面電荷を生成することができます。カンチレバーセンサーは、生命細菌^1,6,7の細胞壁の不安定化に関連付けられた薬物標的相互作用を追跡することができ、彼らがそのために役立つだろう与えられた検索と薬剤耐性感染症と闘うために抗生物質の新しい世代の開発のため。将来カンチレバーで単一細胞²⁶の質量と成長率を測定するためにミクロとして使用されるであろう。カンチレバー技術は、異なる成長因子または薬物に対する細胞応答の研究に有益なことを証明します。それはまた、医療·ポイント·オブ·ケア用途における即時の関連性を有する複数のバイオマーカーの迅速な検出のための新規なツールを提供する。汎用性、小型、カンチレバーセンサのロバスト性を考えると、それらは、有害な環境因子を高感度モニタを形成する。彼らはすでにこのようなフッ化水素酸²⁷またはシアン化水素²⁸などの環境への実験室および工業生産単位から逃れることができる有毒有害なガスの検出、その感度を実証している。