Medición cinética de estado estable, Pre-estado de equilibrio, y un solo volumen de negocios de ADN glicosilasa Actividad

Un ambiente aeróbico acelera la inestabilidad genómica. Una importante lesión del ADN promutagenic resultante de estrés oxidativo es 7,8-dihidro-8-oxoguanina (8-oxo G). Esto es debido al potencial de codificación ambigua de 8-oxo G. Human 8-oxoguanine DNA glicosilasa (OGG1) es responsable de iniciar la base de reparación por escisión de 8-oxo G. La actividad glicosilasa de OGG1 extirpa la base 8-oxo G resulta en ADN producto con un sitio apurinic (AP-site). Una actividad liasa débil OGG1 puede incidir la AP-site en algunos casos.

La caracterización cinética de ADN glycosylases general encuentra que exhiben cursos de tiempo bifásicos. Después de una fase rápida inicial de la formación de producto (es decir ráfaga), una fase de estado estacionario lineal se observó ^1-3. Este comportamiento es indicativo de un paso después de la química (es decir, el cambio conformacional o liberación del producto) siendo limitante de la velocidad durante la parte lineal del curso del tiempo, mientras que la fresaª fase, conocida como la fase transitoria a menudo, corresponde a la formación de producto en el sitio activo de la enzima durante el primer ciclo de la reacción. Cuando liberación del producto es limitante de la velocidad durante la fase de estado estacionario, las mediciones de actividad proporcionan una medida cualitativa del producto afinidad de unión de ADN, pero no proporcionan información cinética relativa a eventos en el sitio activo de la enzima (es decir, química). En consecuencia, se necesitan métodos para aislar y medir la fase de explosión pre-estado estacionario exponencial para investigar los acontecimientos durante la primera rotación enzimática en el sitio activo de la enzima ^4.

Hay tres métodos cinéticos estándar para caracterizar el comportamiento catalítico de OGG1, (1) en estado estacionario, (2) pre-estado de equilibrio, y (3) un solo volumen. Estos enfoques se diferencian entre sí por la concentración de enzima en la mezcla de reacción y la relación de enzima a sustrato utilizado en cada enfoque. En un enfoque típico de estado estacionario,a veces referido como múltiples cinética de volumen de negocios, bajas concentraciones de enzima se utilizan para seguir la formación de producto. La concentración de sustrato excede en gran medida la concentración de la enzima de manera que múltiples pérdidas de balón enzimáticas no afectan significativamente a la concentración de sustrato. En esta situación, los cursos de tiempo debe ser lineal y es a menudo difícil de discernir si un estallido se produjo durante la primera rotación debido a la baja concentración de la enzima utilizada en este enfoque; tenga en cuenta que la amplitud de ráfaga es equivalente a la concentración de la enzima. Esto se puede superar mediante el uso de una mayor concentración de la enzima y la extrapolación de la evolución en el tiempo lineal a tiempo cero para detectar si la primera rotación enzimática ocurrió rápidamente. La intersección con el eje de ordenadas (eje y) debe ser proporcional a la concentración de enzima y proporciona una medida de la enzima participa activamente con el sustrato. Aunque este enfoque puede, en principio, proporcionar evidencia de la existencia de una fase de estallido, un DIFSe requiere enfoque rente para medir la cinética de la fase de estallido. En muchos casos, la fase de estallido es demasiado rápido para medir por técnicas de mezcla y enfriamiento rápido manuales. En esta situación, antes de la cinética de estado estacionario y de un solo volumen de negocios (es decir, cinética transitoria) se acerca a menudo requieren un instrumento rápido de mezcla y enfriamiento rápido para seguir los puntos de tiempo tempranos de una reacción ^5. En un enfoque de pre-estado estacionario se utilizan altas concentraciones de enzima de manera que se forma una cantidad significativa de producto durante la primera rotación. Desde múltiples pérdidas de balón son seguidos para observar bicicleta catalítica (es decir, la fase lineal que sigue a la ráfaga), la concentración de sustrato es mayor que la concentración de la enzima ([enzima] <[sustrato]). Para aislar los eventos en el sitio activo de la enzima sin bicicleta catalítica, se utilizan condiciones de un solo volumen de negocios. En este caso, el sustrato está saturado con la enzima (E >> S) de modo que todo el sustrato participarán in el volumen de negocios único "y normalmente muestran una evolución en el tiempo de un solo exponencial.

Como se ha señalado anteriormente para las enzimas que exhiben una fase de estallido, liberación del producto (k _fuera) a menudo limita la tasa de la fase de estado estacionario de la evolución en el tiempo. La tasa de liberación del producto (v _ss, conc. / Tiempo) se puede determinar a partir de la pendiente de la fase de estado estacionario lineal. Es necesaria la concentración de enzima activa (E) para convertir la tasa de liberación del producto a una constante de velocidad intrínseca donde k _off = v _ss / [E]. Es importante destacar que la concentración de la enzima activa es típicamente más bajo que la concentración medida de proteína debido a las impurezas, enzima inactiva, enzima no productiva obligado a sustrato, y el método utilizado para determinar la concentración de proteína. La concentración de enzima activa puede determinarse a partir de la amplitud de la ráfaga cuando la liberación del producto es lento. Por lo tanto, la extrapolación de un curso de tiempo de estado estacionario atiempo cero proporciona una estimación de la enzima activa necesaria para calcular k _fuera (liberación de producto) de la tasa de estado estacionario observada.

Para medir la cinética de la explosión, un enfoque pre-estado de equilibrio, es necesario seguir la formación de producto durante la primera rotación que se produce antes de la fase de estado estacionario lineal. La cinética de ráfaga sigue la formación de enzima-producto intermedio. Una vez que la reacción se inicia por la enzima de mezclado con el sustrato, la cantidad de la enzima-producto aumenta rápidamente hasta que la reacción alcanza una fase de estado estacionario. Si la catálisis es mucho más rápida que la versión del producto, la amplitud de la ráfaga es igual a enzima participa activamente y el enfoque exponencial observada al equilibrio (k _obs) corresponde a la tasa de conversión química del sustrato a producto, suponiendo que la velocidad inversa de química es insignificante.

En algunos casos CY catalíticaaferrarse interfiere con un análisis previo de estado estacionario, por ejemplo, cuando la magnitud de las tasas para la química y la liberación de productos no son significativamente diferentes. En este caso, el empleo de exceso de enzima con respecto al sustrato evita ciclo catalítico y el sustrato límites unido con la enzima a una sola rotación. En consecuencia, la primera etapa química de la reacción se puede aislar y determinar con precisión como la constante de velocidad de primer orden (k _obs). Esta constante de velocidad debe ser similar a k _obs determinado a partir del enfoque de pre-estado de equilibrio se ha descrito anteriormente.

Aquí se describe cómo estos enfoques cinéticos pueden ser utilizados para analizar la actividad glicosilasa de OGG1.