In vivo beeldvorming methode om acute en chronische ontsteking Onderscheid
Summary
We beschrijven een niet-invasieve beeldvorming methode voor het onderscheiden van inflammatoire fasen. Systemische toediening van luminol onthult gebieden van acute ontsteking afhankelijk MPO-activiteit in neutrofielen. Daarentegen injectie lucigenine maakt visualisatie van chronische inflammatie afhankelijk Phox activiteit in macrofagen.
Abstract
Ontsteking is een fundamenteel aspect van vele menselijke ziekten. In deze video verslag, tonen we aan niet-invasieve bioluminescentie imaging technieken die acute en chronische ontsteking te onderscheiden in muismodellen. Met weefselschade of pathogeen invasie, neutrofielen zijn de eerste verdedigingslinie, spelen een belangrijke rol in het bemiddelen van de acute ontstekingsreactie. Aangezien de inflammatoire reactie verloopt monocyten geleidelijk migreren naar de plaats van verwonding en differentiëren tot rijpe macrofagen, die chronische ontsteking mediëren en weefselherstel bevorderen door het verwijderen weefselstukjes en die anti-inflammatoire cytokines. Intraperitoneale injectie van luminol (5-amino-2 ,3-dihydro-1 ,4-ftalazinedion, natriumzout) maakt detectie van acute ontsteking grotendeels gemedieerd door weefsel-infiltrerende neutrofielen. Luminol specifiek reageert met de superoxide die binnen de phagosomes neutrofielen bioluminescentie sinds gevolg van een myeloperoxidase (MPO) gemedieerde reactie. Lucigenine (bis-N-methylacridinium nitraat) reageert ook met superoxide om bioluminescentie genereren. Echter, lucigenine bioluminescentie is onafhankelijk van MPO en het uitsluitend steunt op fagocytensysteem NADPH oxidase (Phox) in macrofagen tijdens chronische ontstekingen. Samen luminol en lucigenine mogelijk niet-invasieve visualisatie en longitudinale beoordeling van diverse fagocyt populaties in zowel acute als chronische inflammatoire fase. Gezien de belangrijke rol van ontsteking bij een verscheidenheid van menselijke ziekten, geloven we dat niet-invasieve beeldvorming methode kan helpen onderzoeken de differentiële rol van neutrofielen en macrofagen in verschillende pathologische aandoeningen.
Introduction
Ontsteking is een sterk gereguleerd biologische respons bij een verscheidenheid van menselijke ziekten, met inbegrip van microbiële infectie 1, wondgenezing 2, 3 diabetes, kanker 4, 5 cardiovasculaire, neurodegeneratieve 6, 7 en auto-immuunziekten. Weefselontsteking vereist een goede coördinatie van de verschillende immuuncellen om pathogeen klaring, weefselherstel, en de resolutie van de ziekte te bereiken. Neutrofielen en macrofagen zijn belangrijke immuun mediatoren van weefselontsteking. In de acute fase van ontsteking, neutrofielen eerste responders verschillende schadelijke stimuli en weefselschade 8. De neutrofielen snel extravasatie van verkeer naar de plaats van verwonding, waar de cellen inactiveren microben door het vrijgeven antimicrobiële granules en fagocytose. Tijdens fagocytose, overspoelen neutrofielen microben in fagosomen, waarbinnen de cellen produceren hoge niveaus van Superoxide (O 2 · -). Phagosomal superoxide is de primaire bron van vele downstream reactive oxygen species (ROS). Bijvoorbeeld kan superoxide worden dismutated waterstofperoxide (H 2 O 2) door spontane dismutatie of superoxide dismutase (SOD) 9, 10. In neutrofielen, myeloperoxidase (MPO) zet verder waterstofperoxide antimicrobiële hypochloorzuur (HOCl) 11. Aangezien ontstekingsreacties blijven, monocyten geleidelijk migreren naar de plaats van verwonding en differentiëren tot rijpe macrofagen 2, waarvan fagocytosefunctietesten helpen verwijderen geïnactiveerde pathogenen en celresten. Bovendien, als een sleutelrol in de latere fase van ontsteking, macrofaag stimuleert weefselherstel door het produceren van anti-inflammatoire cytokines 12 door het genereren en extracellulaire ROS op een lager niveau 9. De ROS gegenereerd in deze latere fase reguleren weefselremodellering, nieuwe bloedvatvorming en reepitheliabiliseren 13.
Fagocyt NADPH oxidase (Phox) is de primaire bron van superoxide productie in zowel neutrofielen en macrofagen 9. Phox is een multi-subunit complex waarvan de assemblage wordt strak gereguleerd 9. De holoenzyme bevat meerdere cytosole regulerende subeenheden (p67 phox, p47 phox, p40 phox en RAC) en een membraan-gebonden heterodimeer cytochroom b 558 (bestaan uit subunit CYBA en CYBB). Cytochroom b 558 is de reactie kern waarin het CYBB subeenheid (ook bekend als p91 phox en NOX2) voert de primaire redox kettingreactie 9. Interessant is dat de assemblage sites zijn verschillend tussen neutrofielen en macrofagen. In rustende neutrofielen, cytochroom b 558 is vooral aanwezig in het membraan van intracellulaire opslag granules 14. Tijdens fagocytose, neutrofielen assembleren de holoenzymes op phagosomes 9, die een hoog gehalte MPO activiteit aanwezig. De neutrofielen Phox verbruikt snel zuurstof en oefent zijn microbicidal macht door ROS productie, een fenomeen genaamd de respiratoire burst 11. Daarentegen macrofagen een lager MPO expressie en cytochroom b 558 wordt meestal gevonden in de plasmamembraan 15, 16. Zo neutrofielen produceren hoge niveaus van superoxide voor anti-microbiële activiteit, terwijl macrofagen produceren minder superoxide voor regulerende functies 15.
Omdat de ontsteking is een ingewikkeld in vivo proces, zouden niet-invasieve beeldvormende methoden die specifiek zijn voor de verschillende fasen van ontsteking kwantitatieve en longitudinale beoordeling van de ziekte modellen laten. Gebruik mechanistische studies hebben we eerder aangetoond dat het gebruik van twee chemiluminescente agentia, luminol (5-amino-2 ,3-dihydro-1 ,4-ftalazinedion) en lucigenine (bis-N-methylacridinium nitraat)Voor niet-invasieve beeldvorming van acute en late (chronische) stadia van ontsteking, respectievelijk 17. Luminol maakt visualisatie van neutrofielen MPO activiteit in de acute fase van ontsteking 18-20, terwijl lucigenine bioluminescentie kunnen worden gebruikt om macrofaagactiviteit in samenwerking ervan met de late fase of chronische ontsteking 17. In dit manuscript, gebruikten we twee experimentele inflammatiemodellen (sc PMA en sc LPS) om deze beeldvormende technieken demonstreren.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit rapport demonstreren we een bioluminescentie methode voor niet-invasieve beeldvorming van ontsteking bij levende dieren. Gebruikmakend van twee luminescerende substraten, luminol en lucigenine, kan de werkwijze onderscheiden fasen van ontsteking. Luminol bioluminescentie wordt geassocieerd met neutrofielen in de acute fase van ontsteking, terwijl lucigenine bioluminescentie wordt gemedieerd door macrofagen in de chronische fase. Relatief kleine (MW = 177,16 g / mol) en elektrisch ongeladen, kan luminol gemakkelij…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Nancy Lurie Marks Foundation. Wij danken dr. Nancy E. Kohl voor kritische lezing van het manuscript. Wij danken Kin K. Wong voor zijn hulp bij de voorbereiding van dit videoverslag.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | P8139 | |
| Lipopolysaccharide from Salmonella enterica serotype enteritidis | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | L2012 | |
| Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | A4685 | |
| Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | M8010 | |
| IVIS Spectrum imaging system with Living Imaging 4.2 software package | Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA |
References
- Premack, B. A., Schall, T. J. Chemokine receptors: gateways to inflammation and infection. Nat. Med. 2, 1174-1178 (1996).
- Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N. Engl. J. Med. 341, 738-746 (1999).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Inflammation, stress, and diabetes. J. Clin. Invest. 115, 1111-1119 (2005).
- Weitzman, S. A., Gordon, L. I. Inflammation and cancer: role of phagocyte-generated oxidants in carcinogenesis. Blood. 76, 655-663 (1990).
- Ridker, P. M., Cushman, M., et al. Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men. N. Engl. J. Med. 336, 973-979 (1997).
- Wyss-Coray, T., Mucke, L. Inflammation in neurodegenerative disease–a double-edged sword. Neuron. 35, 419-432 (2002).
- Hamilton, J. A. Colony-stimulating factors in inflammation and autoimmunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 533-544 (2008).
- Harlan, J. M. Leukocyte-endothelial interactions. Blood. 65, 513-525 (1985).
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).
- Rest, R. F., Spitznagel, J. K. Subcellular distribution of superoxide dismutases in human neutrophils. Influence of myeloperoxidase on the measurement of superoxide dismutase activity. Biochem. J. 166, 145-153 (1977).
- Hampton, M. B., Kettle, A. J., et al. Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. Blood. 92, 3007-3017 (1998).
- Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nat. Immunol. 6, 1191-1197 (2005).
- Jiang, F., Zhang, Y., et al. NADPH oxidase-mediated redox signaling: roles in cellular stress response, stress tolerance, and tissue repair. Pharmacol. Rev. 63, 218-242 (2011).
- Calafat, J., Kuijpers, T. W., et al. Evidence for small intracellular vesicles in human blood phagocytes containing cytochrome b558 and the adhesion molecule CD11b/CD18. Blood. 81, 3122-3129 (1993).
- Johansson, A., Jesaitis, A. J., et al. Different subcellular localization of cytochrome b and the dormant NADPH-oxidase in neutrophils and macrophages: effect on the production of reactive oxygen species during phagocytosis. Cell. Immunol. 161, 61-71 (1995).
- Kumar, A. P., Piedrafita, F. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma ligands regulate myeloperoxidase expression in macrophages by an estrogen-dependent mechanism involving the -463GA promoter polymorphism. J. Biol. Chem. 279, 8300-8315 (2004).
- Tseng, J. C., Kung, A. L. In vivo imaging of inflammatory phagocytes. Chem Biol. 19, 1199-1209 (2012).
- Gross, S., Gammon, S. T., et al. Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo. Nat. Med. 15, 455-461 (2009).
- Kielland, A., Blom, T., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).
- Zhou, J., Tsai, Y. T., et al. Noninvasive assessment of localized inflammatory responses. Free Radic. Biol. Med. 52, 218-226 (2012).
- Karlsson, A., Nixon, J. B., et al. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. J. Leukoc. Biol. 67, 396-404 (2000).
- Taylor, R. G., McCall, C. E., et al. Histopathologic features of phorbol myristate acetate-induced lung injury. Lab Invest. 52, 61-70 (1985).
- Fukaya, S., Matsui, Y., et al. Overexpression of TNF-alpha-converting enzyme in fibroblasts augments dermal fibrosis after inflammation. Lab Invest. 93, 72-80 (2013).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., et al. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
- Aitken, R. J., Buckingham, D. W., et al. Reactive oxygen species and human spermatozoa: analysis of the cellular mechanisms involved in luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence. J. Cell. Physiol. 151, 466-477 (1992).
- Allen, R. C., Loose, L. D. Phagocytic activation of a luminol-dependent chemiluminescence in rabbit alveolar and peritoneal macrophages. Biochem. Biophys. Res. Commun. 69, 245-252 (1976).
- Caldefie-Chezet, F., Walrand, S., et al. Is the neutrophil reactive oxygen species production measured by luminol and lucigenin chemiluminescence intra or extracellular? Comparison with DCFH-DA flow cytometry and cytochrome c reduction. Clin. Chim. Acta. 319, 9-17 (2002).
- Dahlgren, C., Aniansson, H., et al. Pattern of formylmethionyl-leucyl-phenylalanine-induced luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence in human neutrophils. Infect. Immun. 47, 326-328 (1985).
- Dahlgren, C., Karlsson, A. Respiratory burst in human neutrophils. J. Immunol. Methods. 232, 3-14 (1999).
- Aerts, C., Wallaert, B., et al. Release of superoxide anion by alveolar macrophages in pulmonary sarcoidosis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 465, 193-200 (1986).
- Zhang, N., Francis, K. P., et al. Enhanced detection of myeloperoxidase activity in deep tissues through luminescent excitation of near-infrared nanoparticles. Nat Med. , (2013).
