Cuantitativo<em> In vitro</em> Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas
Summary
Adherencia de los neutrófilos al endotelio activado en los sitios de infección es un componente integral de la respuesta inflamatoria del huésped. Se describe en el presente informe es un ensayo de unión de neutrófilos, que permite la<em> In vitro</em> Cuantificación de neutrófilos humana primaria unión a las células endoteliales activadas por los mediadores inflamatorios en condiciones estáticas.
Abstract
El endotelio vascular juega un papel integral en la respuesta inflamatoria. Durante la fase aguda de la inflamación, las células endoteliales (EC) se activan por los mediadores de acogida o directamente por componentes microbianos conservados peligro o moléculas derivadas del huésped. ECs activados expresan citocinas, quimiocinas y moléculas de adhesión que movilizan, activan y retienen los leucocitos en el sitio de la infección o lesión. Los neutrófilos son las primeras en llegar leucocitos, y se adhieren al endotelio a través de una variedad de moléculas de adhesión presentes en las superficies de ambas células. Las principales funciones de los neutrófilos son para eliminar directamente las amenazas microbianas, promover el reclutamiento de otros leucocitos a través de la liberación de factores adicionales, e iniciar la reparación de la herida. Por lo tanto, su reclutamiento y el apego al endotelio es un paso crítico en la iniciación de la respuesta inflamatoria. En este reporte se describe un ensayo in vitro de la adhesión de neutrófilos mediantecalceína AM marcada con neutrófilos humanos primarios para cuantificar el grado de activación de las células endoteliales microvasculares en condiciones estáticas. Este método tiene la ventaja adicional de que las mismas muestras se cuantificaron por espectrofotometría de fluorescencia también se pueden visualizar directamente mediante microscopía de fluorescencia para una evaluación más cualitativa de la unión de neutrófilos.
Introduction
Dado que el endotelio vascular está en contacto directo con la sangre circulante, que tiene una ubicación única para iniciar una respuesta inflamatoria rápida durante la infección o lesión. Las células endoteliales (EC) receptores de reconocimiento de patrones expresas que reconocen una variedad de componentes bacterianos conservados y las moléculas de peligro, y los receptores para sistemas principales mediadores de la inflamación tales como TNFa. La activación de estos receptores induce ECs para secretar citoquinas (por ejemplo, IL-6, IL-8, CXCL1 y CCL2), y para upregulate moléculas de adhesión (por ejemplo, E / P-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) en su superficie celular 1 , 2. Estas moléculas de todo facilitar la localización de los leucocitos a los sitios de infección y la lesión con el fin de despejar el campo de los agentes infecciosos e iniciar la reparación del tejido 3,4. La respuesta de los neutrófilos a la infección implica una interacción bien coordinada entre el endotelio vascular y la respuesta los neutrófilos. Tras la activación CE, IL-8 se secreta y forma un gradiente intravascular en el endotelio que permite a los neutrófilos a la casa en el sitio de la infección o lesión 5,6. E / P-selectinas median la captura de neutrófilos y rodando a través de asociaciones relativamente débiles con glycomolecules en la superficie celular de neutrófilos. Estas interacciones, junto con la IL-8 la unión a sus receptores afines, facilitan la robusta, unión mediada por la integrina y la eventual detención de los neutrófilos sobre la superficie de la célula endotelial 7-10. Después de la detención, los neutrófilos pueden migrar fuera de la vasculatura a los sitios específicos de infección para eliminar directamente los patógenos, generar trampas extracelulares de neutrófilos para prevenir la propagación de los agentes patógenos, promover la cicatrización de heridas y liberar factores adicionales que reclutan otros leucocitos tales como monocitos, macrófagos y dendríticas 11-17 células.
Se describe en el presente informe es un método in vitro para cuantificar la adhesión de neutrófilos a microVascular ECs después de la activación por el mediador inflamatorio TNF anfitrión. Este ensayo está diseñado para evaluar la activación de EC, y no los neutrófilos. Los neutrófilos humanos primarios son primero aislados utilizando separación por gradiente de densidad, y luego se marcan con calceína acetoximetilo (AM). Esterasas dentro de las células en vivo hidrolizan calceína AM a la molécula calceına altamente fluorescente con una excitación de 492-495 nm y de emisión de 513-516 nm 18. Los neutrófilos marcados con fluorescencia se incuban a continuación con monocapas CE, y los neutrófilos no adherentes se eliminan posteriormente. La fluorescencia de las restantes, neutrófilos enlazados a continuación, se mide utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia, y se calcula como un porcentaje del total de entrada de la fluorescencia de neutrófilos por pocillo. Este método tiene la ventaja adicional de que los neutrófilos calceína-marcado unido utilizados en espectrofotometría se pueden visualizar directamente mediante microscopía de fluorescencia para dar una más cualitativa lectura de CE de corriente alternavación. Puesto que este ensayo se lleva a cabo bajo condiciones estáticas, únicamente los eventos muy iniciales que se producen en la cascada de adhesión de neutrófilos serán evaluados. Esto se confirma en el informe utilizando anticuerpos bloqueantes E-selectina para mostrar que la adhesión de neutrófilos al pulmón humano TNF-tratada microvascular CE (HMVEC-pulmón) monocapas se reduce drásticamente cuando se interrumpe la interacción con E-selectina.
Además de TNFa, hemos utilizado con éxito este ensayo para determinar la extensión de la vena activación CE umbilical humana (HUVEC) por el receptor de tipo Toll medio agonistas lipoproteína asociada a peptidoglicano (PAL), mureína lipoproteína (MLP) y Pam3Cys y activación HMVEC-Pulmón por Pam3Cys 19,20. Además, hemos utilizado con éxito este ensayo con inhibidores de la quinasa y después de RNAi mediada desmontables de superficie y proteínas citoplasmáticas en HMVEC-pulmón, lo que sugiere que esta metodología es compatible con una variedad de bioquímica y screeninensayos de 20 g. En resumen, este ensayo proporciona una fácil de usar, forma reproducible, más funcional para acceder a la medida de la activación de CE por mediadores inflamatorios in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos más importantes para el éxito de neutrófilos / ensayo de adhesión celular endotelial microvascular son los siguientes: 1) El uso del número de paso bajo (<9), células endoteliales sanas, 2) El mantenimiento de los neutrófilos aislados con una densidad baja (es decir, células <5 x 10 6 / ml) y el uso de ellos en las dos horas de aislamiento, y 3) el lavado Fastidious de los neutrófilos calceína AM-etiquetados y el uso de los neutrófilos calceína AM-etiquetados de manera opo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Anestesia y Cuidados perioperatorios UCSF.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Can be substituted with any vendor |
| 48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (without phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Can be substituted with any vendor |
| D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Can be substituted with any vendor |
| RPMI-1640 (without phenol red) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) stock soln |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μM filters | VWR | 21008-949 | Can be substituted with any vendor |
| FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer | BMG LABTECH | – |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
- Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
- Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
- Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
- Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
- Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
- Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
- Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. . The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , (2005).
- Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).
- Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
- Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
- Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
- Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
- Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
- De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
- Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
- Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
- Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
- Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
- Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
- Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
- Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
- Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
- Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
- Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
- Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).
