정량<em> 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는> 분석
Summary
감염의 사이트에서 활성화 된 내피 세포에 백혈구 준수는 호스트의 염증 반응의 중요한 구성 요소입니다. 수 있습니다 호중구 결합 분석은이 보고서에 설명<em> 체외에서</em정적 조건에서 염증 매개 물질에 의해 활성화 된 내피 세포에 바인딩 인간의 기본 호중구의> 정량.
Abstract
혈관 내피 세포는 염증 반응에 중요한 역할을한다. 염증의 급성 단계 동안, 내피 세포 (내피)는 호스트 매개로 직접 보존 미생물 구성 요소 또는 호스트 파생 위험 분자에 의해 활성화됩니다. 활성화 된 내피 표현 사이토 카인, 케모카인 동원과 접착 분자는, 감염이나 부상의 사이트에서 백혈구를 활성화하고 유지합니다. 호중구 도착하는 최초의 백혈구이며, 두 세포의 표면에 존재하는 접착 분자의 다양한 통해 내피을 준수합니다. 호중구의 주요 기능은 직접 미생물의 위협을 제거하는 추가 요인의 출시를 통해 다른 백혈구의 채용을 촉진하고, 상처 복구를 시작하는 것입니다. 따라서 내피 세포에 자신의 모집 및 첨부 염증 반응의 개시에 중요한 단계입니다. 이 보고서에서, 우리는 사용하는 체외 호중구 접착 분석에 대해 설명합니다calcein 정적 조건에서 미세 혈관 내피 세포의 활성화 정도를 정량하는 인간의 기본 호중구 AM-레이블. 이 방법은 형광 분광 광도계로 정량 동일한 샘플을 직접 호중구 바인딩보다 질적 평가를 위해 형광 현미경을 사용하여 시각화 할 수있는 추가적인 장점이 있습니다.
Introduction
혈관 내피 세포는 혈액 순환과 직접 접촉에 있기 때문에, 그것은 유일하게 감염이나 부상시 신속한 염증 반응을 시작할 수 있습니다. 내피 세포 (내피) 보존 세균의 구성 요소와 위험 분자의 다양성을 인식하고 표현 패턴 인식 수용체, 그리고 TNFα와 같은 호스트에 염증 매개체에 대한 수용체. 이들 수용체의 활성화는 내피는 사이토 카인 (예를 들어, IL-6, IL-8, CXCL1 및 CCL2) 분비하고, 그들의 세포 표면 1에서 부착 분자 (예를 들어, E / P-셀렉틴, VCAM-1, ICAM-1)를 상향 조절을 유도 2. 이 분자는 모든 전염성 에이전트의 호스트를 삭제하고 조직 수선에게 3,4을 시작하기 위해 감염과 부상의 사이트에 백혈구의 국산화를 촉진한다. 감염 호중구 반응은 혈관 내피 세포와 응답 사이의 잘 조율 된 상호 작용을 포함 호중구. EC의 활성화에 따라, IL-8 분비 감염이나 부상 5,6의 사이트에 집으로 호중구 수있는 내피 세포에서 혈관 그라데이션을 형성하고 있습니다. E / P-셀렉틴를 중재 호중구 캡처 및 호중구 세포 표면에 glycomolecules 상대적으로 약한 연결을 통해 압 연입니다. 이러한 상호 작용은 그 동족 수용체 IL-8 바인딩과 함께, 강력한, 인테-매개 부착과 내피 세포 표면 7-10 호중구 결국 체포를 용이하게합니다. 체포 후 호중구가 직접 병원균을 제거 병원균의 확산을 방지하기 위해 호중구 세포 트랩을 생성, 상처 치유를 촉진하고 단핵구, 대 식세포 및 수지상 등의 백혈구를 모집하는 추가 요인을 풀어 감염의 특정 사이트에 혈관 밖으로 마이그레이션 할 수 있습니다 세포 11-17.
microv에 호중구 부착을 정량 할 수있는 체외 방법은이 보고서에 설명ascular는 TNFα 호스트 염증 매개체에 의해 활성화 된 후 ECS. 이 분석은 내피의 활성화, 그리고 호중구을 평가하기 위해 설계되었습니다. 인간의 기본 호중구 먼저 밀도 기울기 분리를 사용하여 격리하고, 다음 calcein 아세 톡시 (AM)로 표시되어 있습니다. 살아있는 세포 가수 분해 calcein에서 에스 테라 제는 492-495 nm의 513-516 nm의 18의 배출 여기에 높은 형광 calcein 분자 오전. 찬란 – 라벨 호중구는 다음 EC 단층으로 배양되고, 비 부착 호중구는 이후에 제거됩니다. 나머지 바운드 호중구의 형광 그 형광 분광 광도계를 사용하여 측정하고, 잘 당 총 호중구 형광 입력의 비율로 계산됩니다. 이 방법은 분광 광도계에 사용되는 바인딩 calcein – 라벨 호중구가 직접 EC의 AC 읽어 더 많은 정성을 제공하는 형광 현미경을 사용하여 시각화 할 수있는 추가적인 장점이 있습니다tivation. 이 분석은 정적 인 조건에서 수행되기 때문에, 호중구 부착 폭포에서 발생 만 매우 초기 이벤트가 부과됩니다. 이 TNFα 처리 인간의 폐 혈관 EC (HMVEC 폐)에 해당 호중구 준수 E-셀렉틴과의 상호 작용이 중단 될 때 단일 층이 대폭 감소를 표시하는 E-셀렉틴 차단 항체를 사용하여이 보고서에서 확인됩니다.
TNFα에 더하여, 우리는 성공적으로 수신자 같은 수용체 1 / 2 작용제 펩티도 글리 칸과 연관된 지단백 (PAL), murein 지방 단백질 (MLP)와 Pam3Cys에 의해 인간 제대 정맥 EC (HUVEC) 활성화의 범위를 결정하기 위해이 분석을 사용했습니다 Pam3Cys 19,20으로 HMVEC 폐 활성화. 또한, 우리는 성공적으로이 방법론의 다양한 호환되는 제안, 키나제 억제제와 HMVEC 폐의 표면과 세포질 단백질의 RNAi를 매개 최저 한 후이 분석을 사용 생화학 screeninG의 분석 20. 요약하면,이 분석은 체외에서 염증 매개 물질에 의해 EC 활성화의 범위를 액세스 할 재현성, 더 많은 기능을 방법을 사용하기 쉽게 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
성공적으로 호중구 / 미세 혈관 내피 세포 접착 분석을위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 낮은 통로 번호 (<10), 건강한 내피 세포의 사용, 낮은 밀도 (즉, <5 × 10 6 세포에서 분리 된 호중구를 유지 2) / ㎖) 및 분리 2 시간 이내에 그들을 사용하여, 각각 3) 까다로운 calcein AM-라벨 호중구의 세척 및 호중구에서 calcein의 EC 오염과 손실을 최소화하기 위해 적시에 calcein AM-라?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 마취와 수술 전후 관리의 UCSF 부에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Can be substituted with any vendor |
| 48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (without phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Can be substituted with any vendor |
| D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Can be substituted with any vendor |
| RPMI-1640 (without phenol red) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) stock soln |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μM filters | VWR | 21008-949 | Can be substituted with any vendor |
| FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer | BMG LABTECH | – |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
- Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
- Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
- Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
- Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
- Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
- Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
- Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. . The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , (2005).
- Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).
- Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
- Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
- Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
- Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
- Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
- De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
- Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
- Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
- Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
- Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
- Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
- Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
- Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
- Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
- Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
- Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
- Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).
