FDAの承認を受けたVero細胞におけるワクチン開発のための組換えアレナウイルスの生成
Summary
クローニングされたcDNAからの組換えアレナウイルスのレスキュー、逆遺伝学と呼ばれるアプローチは、研究者はアレナウイルスの生物学のさまざまな側面に、特定のウイルス遺伝子産物の役割、ならびにそれらの異なる特定ドメイン及び残基の寄与を調べることができ。同様に、人間の病原アレナウイルスに対抗するための効果的かつ安全なワクチンの生成のための新規な可能性を提供するワクチン開発のためのFDA承認された細胞株（ベロ）における遺伝学技術を逆転。
Abstract
アレナウイルス逆遺伝学の開発と実装は、アレナウイルスフィールド4の重要な進歩を表しています。彼らのゲノム内の所定の変異を有する組換え伝染アレナウイルスを生成する機能と一緒にセルベースアレナウイルスミニゲノムシステムの使用は、アレナウイルスのライフサイクルの異なる段階にウイルス決定因子の寄与の調査だけでなく、ウイルスのホストを促進してきたアレナウイルス病因1、3、11の相互作用とメカニズム。また、trisegmentedアレナウイルスの開発は、このようアレナウイルスベースのワクチンベクター·アプリケーション5の可能性を開いて、関心のある付加的な外来遺伝子を発現するアレナウイルスゲノムの利用を許可している。同様に、レポーター遺伝子を発現することができる単一サイクル感染アレナウイルスの開発がhighlて研究の安全性を向上させるために新しい実験ツールを提供Y病原人間アレナウイルス16。プラスミドに基づく逆遺伝学技術を用いた組換えアレナウイルスの生成は、これまでの食品医薬品局の開発（FDA）認可されたワクチンまたはワクチンベクターのためのいくつかの障害を引き起こし7,19齧歯類細胞株の使用に頼っている。この障害を克服するために、我々は、FDAが承認したVero細胞における組換えアレナウイルスの効率的な世代はここに記述します。
Introduction
アレナウイルスは、 アレナウイルス科に属するbisegmented、マイナス鎖RNAゲノム3エンベロープウイルスである。アレナウイルスゲノムは3 2つの別々のウイルスのセグメントからambisenseファッションの4つのタンパク質をコードしている。大（L）セグメントは、出芽ウイルスの主要な原動力として機能するRNA依存性RNAポリメラーゼ（L）と小RING（実際おきたい新規遺伝子）フィンガータンパク質（Z）をコードする。小（S）のセグメントは、ウイルス核タンパク質（NP）と表面糖タンパク質（GP）（ 図1）をコードする。
アレナウイルス科のいくつかのメンバーは、人間3で致死性出血熱（HF）を担当しています。原理上の問題の入院患者8、図9において高い死亡を引き起こすことが知られているラッサウイルス（LASV）とフニンウイルス（JUNV）がある。これらのウイルスは、それぞれ西アフリカと農村アルゼンチン、固有種であるが、増加した旅行10に起因する非流行地域へLASVとJUNVの輸入の増加が懸念される。通常、ヒトの重篤な疾患に関連付けられていないものの、さらに、原型アレナウイルスリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）は免疫不全患者6、15に致命的感染症の場合があったように無視された病原体とみなされ、先天性先天性欠損症と自然流産の責任です妊婦2、13インチ現在アレナウイルスと治療に対して何の米国FDAの承認を受けたワクチンが存在しない部分的にしか有効であり、多くの場合、重大な副作用に関連付けられているヌクレオシドアナログリバビリン、に限定されています。
プラスミドベースのリバースジェネティクス4および組み換えアレナウイルス7、19の世代の導入は大幅アレナウイルス研究の分野を進めてきた。現在、齧歯類細胞（例えば、BHK-21など）GENERのために使用されるSとLのセグメントの初期の転写を誘導する種特異的ネズミRNAポリメラーゼI（POL-I）プロモーターによる換えアレナウイルスのATION。 BHK-21細胞におけるウイルスしかし救助は、潜在的なワクチンシード候補として換えアレナウイルスの生成のための承認された方法ではありません。ここでは、原型旧世界（OW）LCMVと新世界（NW）Vero細胞におけるJUNVスナップ＃1株の効率的な救助のための人間のPOL-Iプロモーターを使用することを文書化します。類似した方法論を用いて、我々は、組換えtrisegmented LCMV（r3LCMV）と2つの異なるS RNAセグメント5でエンコードされた二つの追加外来遺伝子が含まれている（＃1 r3Candid）＃1スナップアレナウイルスを生成しました。この新しいシステムでは、再現性の高い、シンプルなプロトコルに従いますが、すぐに潜在的なワクチンまたはワクチンベクターのシードとして換えアレナウイルスの生成で実装することができませんだけ。
Protocol
Representative Results
Discussion
プラスミドベースの逆遺伝学的手法を用いて組換えアレナウイルスの生成は、アレナウイルス生物学のさまざまな側面の研究のために広く使われているアプローチとなっています。ここでは、アレナウイルスを実行して、現在のシステムに不可欠な改善を文書化し、他の感染症に対するアレナウイルスとワクチンベクターに対するFDAの承認を受けたワクチン候補の電位発生を可能にし、Vero細…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、アレナウイルスの逆遺伝学技術とプラスミドの開発·改善のためのJCTとLM-S研究所で過去と現在のメンバーに感謝。また、技術的なサポートのためSnezhana Dimitrovaに感謝します。 JUNV NP（SA02-BG12）に対するモノクローナル抗体は、BEIリソース（NIAID生物兵器防衛と新興感染症研究資源·リポジトリ）から得た。 BYHCは、インスティテューショナル·ルースL.キルシュシュタイン国立リサーチサービス賞からグラント番号GM068411によってサポートされていました。 EO-Rはフルブライト-Conicyt（BIO 2008）とロチェスターワクチンフェローシップ（2012）受取人である。 EO-R現在のサポートは、ロチェスター大学のファカルティ·ディベロップメント＆多様性事務局からダイバーシティ＆アカデミック優秀ポスドクフェローシップによって提供されます。 LM-S研究室の研究は、NIHの助成金RO1 AI077719、R21NS075611-01、R03AI099681-01A1、インフルエンザ研究および監視のためのエクセレンスNIAIDセンター（HHSN266200700008C）によって資金を供給され、生物兵器防衛免疫モデリング（HHSN272201000055C）用ロチェスターセンターの大学。
JCT実験室での研究は、NIHから助成金RO1 AI047140、RO1 AI077719とRO1 AI079665によってサポートされていました。
Materials
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Cell lines Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). Plasmids All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer’s recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. Viruses The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells. Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA. |
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