Analyses comportementales automatisés à haut débit dans les embryons de poisson zèbre

1. Collection d'embryons de poisson zèbre et Raising larves Verre plats en pyrex avec de l'herbe "faux" (à partir de fils vert) (Figure 1) doivent être insérés dans les réservoirs à l'aube et ont quitté pendant deux heures afin de recueillir des embryons de poisson zèbre. Les plats en verre contenant les embryons doivent être versé sur un tamis de poche et rincées à l'eau déminéralisée. Les embryons doivent ensuite être cultivées dans l'eau d'œuf. L'eau d'oeuf contient 60 mg / L d'Instant Ocean dans de l'eau déminéralisée et 0,25 mg / l de bleu de méthylène, qui est utilisé comme un inhibiteur de moisissures. Selon l'hypothèse de l'expérience individuelle, les embryons peuvent être traités immédiatement ou au cours des étapes spécifiques du développement de l'utilisation des substances toxiques ou des produits pharmaceutiques. Les substances toxiques et les produits pharmaceutiques sont généralement dissous dans du DMSO (à une concentration de 1000 X) et devraient être davantage dilués directement dans le milieu de l'eau d'œuf. Pendant le traitement embryonnaire et larvaire avec des produits pharmaceutiques ou des substances toxiquess, les larves et les embryons peuvent être logés dans des boîtes de Pétri profondes à une densité d'environ 50-60 larves par 50 ml jusqu'à ce que les analyses comportementales au 7 DPF (solution d'eau œuf doit être changé au moins tous les deux jours pour éviter la croissance de champignons / bactéries à partir d'embryons morts). 2. Préparation de Moules pour les analyses comportementales Spécialement développé des moules en plastique qui mesurent 11,7 cm x 7,6 cm x 5 mm ont été construit sur mesure en interne. Les moules sont nécessaires pour créer les voies à l'aide d'agarose qui est versé dans des assiettes en plastique et simples de Thermo Scientific. La seule mesure de plaques ainsi 12.4 cm x 8.1 cm x 1.2 cm. Les moules contiennent cinq voies dans lesquelles les faces sont inclinées à 60 °. Les voies de circulation dans les moules sont de 3,5 mm de hauteur avec une base de 18 mm dans la partie supérieure qui est la plus large tandis que la largeur du bas est de 14 mm. Il ya un écart de 4 mm entre voies dans le moule (Figure 2). Pour préparer les voies versez 50 ml de fondue agarose (0,8% d'agarose dans désioniserd eau avec 60 mg / L Instant Ocean) dans une assiette bien seul. Le moule doit alors être placée très lentement au-dessus de l'agarose liquide pour éliminer toute formation de bulles et peut être retiré lors de l'agarose soit refroidi (ce qui prend environ 45 min). Les voies d'agarose doivent être faites au plus tôt un jour avant l'expérience comportementale doit être exécuté (pour éviter le dessèchement agarose) Les voies peuvent être conservés à température ambiante avec les couvercles sur les plats jusqu'à environ 36 h. Les voies d'agarose ne devraient être utilisés pour une expérience et doivent ensuite être jetés. 3. Capture d'image Jusqu'à 20 larves peut être placé dans chaque voie des plaques. Typiquement 5 larves par voie sont utilisés pour faciliter le suivi plus précis de la vitesse de nage et de réduire le nombre de larves qui sont nécessaires par expérience. Les voies peuvent être remplis avec de l'eau d'œuf avec ou sans médicaments ou des produits toxiques en fonction de l'expérience. Toutefois, les voies ne doivent pas être filled tout le chemin jusqu'à ce qu'ils soient placés dans les armoires d'imagerie, ce qui va empêcher le débordement. Par souci de cohérence, les larves doivent avoir une période d'acclimatation de dix minutes après ils sont placés dans des moules agarose et positionnées sur le dessus de l'écran du portable. Déplacer efficacement les larves de la boîte de Pétri sur la voie agarose aidera à réduire le stress des larves. C'est plus facile lorsque les larves sont logés dans des réservoirs peu profonds ou des boîtes de Pétri. Les cabinets d'imagerie incluent un appareil photo numérique Canon utilisé pour la photographie time-lapse et un ordinateur portable. L'appareil doit être placé en haut de l'armoire et dirigé vers le bas de l'armoire où un ordinateur portable à écran 15,6 pouces devrait être placé avec écran vers le haut (figure 3). Quatre plaques doivent être positionnés à la main directement sur l'écran du portable. À cette époque, les voies peuvent être surmontés avec de l'eau de l'œuf ou de traitement chimique afin qu'il soit au niveau du haut de la voie (pour éliminer les ombres sur les bords de la lanes dans les images). Une présentation PowerPoint est utilisé comme un stimulus aversif pour les larves. Dans les mobiles dernières boules rouges ont été sans poisson-zèbre larves dans les 6 ou 12 plaques multi-puits 15.17.18. La PowerPoint courant commence avec un fond blanc pendant 15 min, puis 15 min d'une barre rouge en mouvement sur ​​la moitié supérieure de la plaque (figure 4). Afin d'éliminer les larves de surchauffe, il est préférable d'acheter un ordinateur portable avec une température de l'écran qui ne dépasse pas 28 ° C. Pour éviter l'évaporation du liquide dans les couloirs d'agarose, le temps d'imagerie maximale doit être maintenue au-dessous d'une heure. La caméra numérique devrait être programmé pour time-lapse photography, prendre des photos toutes les 6 sec pour un total de 300 images par expérience. Toutefois, la fréquence et la longueur peut être ajustée en fonction de l'expérience et de la quantification du comportement. Au cours des dernières fois d'imagerie longues étaient employés en utilisant des intervalles plus longs entre chaque image. Le camerun peut être réglé à une résolution plus faible pour l'imagerie à la vitesse de la vidéo (30 images par seconde). Alors que la résolution plus faible limite les enregistrements sur une plaque multi-puits unique, les enregistrements vidéo sont appropriés pour l'imagerie épreuves de natation rapides 15. 4. Analyse d'Image Les images devraient être ouvertes avec ImageJ et sont utilisés avec une macro qui a été écrit spécifiquement en interne. La macro divise automatiquement les canaux de couleur de sorte que la couleur rouge peut être enlevé, soustrait le fond, applique un seuil, et identifie les larves par analyse de particules. La macro la plus récente pour cinq voies analyse larvaire est Zebrafish_macro25k. Utilisez les invites de la macro pour définir le nombre d'images, la couleur doit être soustrait, le seuil d'image, etc Après que toutes les images sont exploités par la macro ImageJ, un fichier de résultats sera affichée et contiendra des coordonnées x, y de la larve individuel pour chaque image avec le numéro de l'image et le nombre de voie. </li> Le fichier de résultats doit être sauvegardé en format Excel et triées en fonction de fond blanc ou vers le fond de bar, puis le numéro bien. Un modèle Excel doit être utilisé qui a équations construites en qui détermine automatiquement le placement des larves dans les puits, la distance entre les larves, la vitesse de mouvement et temps de repos. Le modèle Excel plus courant est 25ib créé dans le laboratoire Creton, qui est disponible sur demande. Graphes montrant les différents groupes de traitement doivent être intégrées dans la feuille Excel avec des tests t pour la comparaison entre les groupes de traitement et de contrôle. Une analyse statistique plus peut être réalisée en utilisant SPSS.