포르말린에서 프로테오믹스 샘플 준비 파라핀 조직에게 고정 및

1. 계측 필수 미세 절제 및 샘플 용해를위한 조직 조각의 준비 Thermoblock 99 ° C 또는 끓는 물에 목욕을 설정합니다. 레이저 운영 microdissector (예 : PALM, 혈구, 괴팅겐, 독일). 온도 조절 벤치 탑 원심 분리기, 온도는 20 ℃로 설정 에펜 도르프 형 처리 튜브 랙 젖은 챔버 (상자). 창업 보육 센터는 37 ° C로 설정 마이크로 규모의 석영 큐벳 (0.1 ~ 0.2 ㎖)으로 자외선 근처에 여기 형광의 측정을 가능하게 분광. 2. 솔루션 '조직 용해 버퍼'(TLB) : 0.1 M 트리스 – 염산, pH를 8.0, 0.1 M DTT, 0.5 % (w / v)의 폴리에틸렌 글리콜 2 만 4 % SDS의. UA 솔루션 : 0.1 M 트리스 – 염산의 pH 8.5에서 8 M 요소. 1 샘플 당 1 ㎖를 준비합니다. UA와 IAA 솔루션 갓 준비하고 하루 내에서 사용되어야한다. IAA 솔루션 : 0.05 M 전UA에 odoacetamide. 1 샘플 당 0.1 ML를 준비합니다. 엔도리스 – C, 원액. 트립신, 원액. '소화의 버퍼 (DB) : 0.05 M 트리스-HCl을 pH가 8.5. 1 샘플 당 0.25 ML을 준비합니다. '트립토판 표준 용액'1 ㎖ 탈 이온수에 0.1 μg 트립토판. '분석 버퍼 B'(ABB) : 10 mM 트리스 – 염산, pH가 7.6. 브리튼 & 로빈슨 보편적 인 버퍼 (BRUB)의 원액. 0.1 M CH 3 COOH, 0.1 MH 3 PO 4, 0.1 MH 3 BO 3를 함유하는 용액을 준비하고 필요에 pH를 1 M NaOH로 조정 (2, 4, 5, 6, 11). 사용하기 전에 탈 이온수로 5 배 희석. 탈 이온수 1 % (V / V) CH 3 COOH : 버퍼. 버퍼 B : 60 % (V / V) CH 3 CN, 1 % 탈 이온수 (V / V) CH3COOH. 3. 피펫 팁 및 'StageTip'열 콜로라도에있는 Empore – 음이온 막 6 층을 적층하여 SAX 팁 열 준비MMON 0.2 ML 피펫 팁. 샘플 당 두 SAX 팁 열을 확인합니다. 0.2 ML 피펫 팁에 Empore-C (18)의 3 층을 적층하여 'StageTip'을 준비합니다. 각 샘플에 대한 6 단계의 팁을 확인합니다. 4. 미세 절제를위한 조직 조각의 준비 및 샘플 용해 마이크로톰와 섹션 잘라 (슬라이스의 두께가 샘플에 따라 달라. 보통 미세 절제가 7 ~ 10 μm의 조각을 잘 작동합니다). 45 분 동안 UV 빛으로 막 슬라이드 (MembraneSlide 1.0 PEN)을 조사. 2 시간 동안 37 ° C에서 조사하는 막 슬라이드 및 건조에 섹션을 탑재합니다. 2.5 분, 1.5 분 동안 크실렌에서 두 개의 연속 배양하여 장착 섹션을 Deparaffinize. 연속 배양에 무수 에탄올, 70 % 에탄올, 물, 1 분 동안 각각에 의해 섹션 재수. 20 초 동안 메이어의 헤 마톡 실린과 섹션을 얼룩 1 분, 공기 건조 물로 헹군다. 셀 populati 수집레이저 캡처 미세 절제 시스템을 사용하여 관심에. PALM 악기 (혈구)를 사용하는 경우 접착제 모자의 샘플 (접착 CAP 200)를 수집합니다. 모자에 microdissected 자료에 TLB의 나누어지는 피펫. 튜브를 닫고 짧은 원심 분리하여 현탁액을 수집합니다. 를 Lyse 1 시간 동안 교반 (600 RPM)와 가열 블록에서 99 ° C에서 microdissected 조직. microdissected 조직의 10 NL에 대한 버퍼의 3 μl를 사용합니다. 10 분 동안 18 ° C에서 16,000 XG에서 원심 분리하여 조 추출물을 명확히. 용해 액은 -20 ℃에서 냉동 저장 될 수있다 5. 샘플 처리 솔루션의 10 μL가 필터에 남아 때까지 200 한외 여과 단위 UA의 μL (법의학 30K) 14,000 XG에 원심 분리기로 명확히 용해 액 50 μL까지 섞는다. 보통이 단계는 10 ~ 15 분 원심 분리가 필요합니다. 한외 여과 장치에 UA 200 μl를 피펫5.1에서와 같이 원심 분리기. 포집 관을 비 웁니다. 피펫 50 IAA 솔루션의 μL와 5.1로 1 분간 원심 분리를위한 열 혼합기에서 600 rpm으로 혼합한다. 5.1과 한외 여과 장치와 원심 분리기에 UA 100 μl를 피펫. 두 번이 단계를 반복합니다 5.1에서 한외 여과 장치와 원심 분리기에 대한 DB의 피펫 100 μL. 두 번이 단계를 반복합니다. 새 컬렉션 튜브에 여과 장치를 전송합니다. 피펫 40 μL의 엔도리스-C (1:100의 총 단백질 비율을 단백질 분해 효소)와 DB 및 1 분 동안 열 믹서에서 600 rpm으로 혼합한다. 18 시간 동안 37 ° C에서 젖은 실의 단위를 품어. 같은 5.1로 14,000 XG에서 필터 유닛을 원심 분리기. 5.1에서와 같이 탈 이온수와 원심 분리기 필터 유닛의 피펫 160 μL. 풀링 흐름을 통해 (5.7 및 5.8 단계) 엔도리스 C. 발표 한 펩티드를 포함 새 컬렉션 튜브에 한외 여과 장치를 전송합니다. 40 μl를 추가합니다트립신 (단백질 비율 1:100 효소)와 DB 및 1 분 동안 열 – 혼합기에서 600 rpm으로 혼합한다. 4 시간 동안 37 ° C에서 젖은 실의 단위를 품어. 반복 트립신 펩티드를 수집하기 위해 5.7 및 5.8 단계를 반복합니다. 6. 펩티드의 정량 트립토판 잔기는 용매에 잘 접근하기 때문에 단백질 다이제스트의 펩티드 함량의 측정은 희석 완충액에서 수행 될 수있다. 석영 큐벳에 ABB의 0.2 ML을 피펫과 '빈'의 발광 스펙트럼을 기록합니다. ABB와 큐벳 부드러운 믹스에 TSS의 1 μL 씩 분주을 추가하여 0.1 μg 단계를 사용하여 검량선을 작성. 큐벳을 청소합니다. 샘플을 피펫 스펙트럼 (샘플)을 기록. 단백질과 펩타이드 농도의 계산 0.1 μg 트립토판 B를 수득 단백질 혼합물의 트립토판 함량의 평균 1.1 %에 대하여 약 15 μg 단백질 (에 대응하는시기Y)는 인간의 세포를 용균의 단백질 함량은 다이제스트에서 샘플이나 펩티드 함량 같다 : F (표준 1)은 0.1 μg 트립토판 표준의 형광입니다. 펩티드 함량은 소화 과정의 수율을 계산할 수 있으며 펩티드 분획 및 질량 분광 분석을 위해 다음과 같은 중요한 정보를 제공한다. 7. 리스-C 및 트립 틱 펩티드의 분류 각각 BRUB의 pH (11)의 pH 5의 0.2 ML로리스 – C와 트립신 digestions에 의해 얻어진 펩타이드 솔루션을 희석. 원심 튜브 어댑터 뚜껑 SAX 팁 열을 조립합니다. BRUB,리스 – C pepti의 분리 pH를 11 0.1 ㎖의 메탄올 0.1 ㎖로 연속적으로 1 M의 NaOH 0.1 ㎖, 3 번 SAX 팁 열을 씻고 평형데와 BRUB, 트립신 펩티드의 pH 5. 컬럼 재료를 통한 용액의 흐름은 4000 X g에서 원심 분리에 의해 용이하게된다. 의리스 – 분리를위한 4; 'StageTips'- 세척 및 C 18 평형 – 다음 이후로 'StageTips', 메탄올 0.05 ㎖, 버퍼 B 0.05 mL를하고 버퍼 A. 0.05 ㎖의 여섯 C (18) 준비와를 C 펩타이드 및 트립신 펩티드의 분리를위한이. 'StageTip'- C (18)의 SAX 팁 열을 조립합니다. 평형 SAX 팁 – 열에 샘플 솔루션을로드하고 3 분 5,000 XG에서 열을 원심 분리기. 0.1 각각 LYC-C에 BRUB ml의 pH를 11 또는 pH를 5 및 트립신 샘플 '피펫 팁'열 평형. 5,000 X g에서 원심 분리하여 흐름을 촉진. 다음 C (18)에 SAX 팁 열 이동 – 'StageTip'. 리스 C 샘플과 BRU와 BRUB pH를 6, 4, 2 펩타이드의 용출 계속트립신 펩티드와 샘플 B의 pH를 2. 'StageTip'- 각 용출 단계는 별도의 C (18)을 사용하십시오. 버퍼 A. 0.05 ㎖로 'StageTips'- C (18)를 세척 질량 분석기로 조립 LC 시스템에 시료 주입 바이알에 직접 사용할 버퍼 B 0.05 ㎖의 분획을 용출.