修正了福尔马林蛋白质组学样品的制备和石蜡包埋组织

1。仪表所需用于显微切割和裂解样品制备组织切片加热块设定到99°C或用开水洗澡。 激光器的工作microdissector（例如PALM，蔡司，哥廷根，德国）。 恒温台式离心机，温度设定为20℃。 湿室（箱）与机架的Eppendorf型处理管。 孵化器设定为37°C。 荧光分光光度计使荧光激发近紫外光与微观尺度的石英比色皿（0.1-0.2毫升）的测量。 2。解决方案 “组织裂解液”（TLB）：为0.1M的Tris-HCl，pH值8.0，0.1M DTT，0.5％（重量/体积）聚乙二醇20000和4％SDS中。 UA解决方案：8M尿素的0.1M的Tris-HCl pH值为8.5。准备每1样品1毫升UA和IAA的解决方案必须新鲜配制，并在一天之内使用。 IAA的解决方案：0.05 M Iodoacetamide在UA。准备每样0.1毫升。 内蛋白酶赖氨酸-C原液。 胰蛋白酶，原液。 “消化缓冲”（DB）：0.05 mol的Tris-HCl pH值为8.5。准备每样0.25毫升。 '色氨酸标准溶液'：0.1微克色氨酸1毫升去离子水。 “测定缓冲液B'（ABB）：10mM的Tris-盐酸，pH值7.6。 原液布里顿和罗宾逊通用缓冲液（BRUB）的。制备含0.1M CH 3 COOH，0.1 MH 3 PO 4和0.1 MH 3 BO 3的溶液，用1M的NaOH调节至所需的pH值（2，4，5，6，和11）。在使用前稀释5倍的去离子水。 缓冲液A：1％（V / V）CH 3 COOH在去离子水中。 缓冲液B：60％（V / V）CH 3 CN，1％（V / V）CH 3 COOH中的去离子水。 3。移液器吸头和'StageTip专栏通过堆叠6层Empore，阴膜在共同准备SAX尖柱MMON0.2毫升的枪头。使每个样品2 SAX尖柱。 在0.2毫升吸管尖端堆叠3层Empore-C 18的准备“StageTip”。使每个样品6级提示。 4。组织切片进行显微切割的制备及样品裂解切割用切片机切片（切片的厚度取决于样品。一般显微能够很好地为7-10微米的切片）。 照射膜载玻片（MembraneSlide 1.0 PEN）与UV光45分钟。 安装在照射到膜幻灯片和干燥的部分，在37℃下2小时。 Deparaffinize的安装部分通过在二甲苯中的两个连续孵育2.5分钟和1.5分钟。通过连续孵育在无水乙醇，70％乙醇和水，每1分钟，再水合的部分。 染色与Mayer的苏木20秒的部分，用清水冲洗1分钟，并风干。 收集细胞populati在使用激光捕获显微切割系统的兴趣。当使用Palm仪（蔡司）收集粘合瓶盖样品（胶粘剂第200章）。 吸取TLB中的等分试样通过在盖的显微切割的材料。关闭管和一个短暂离心收集悬浮液。裂解在99℃，搅拌（600转）1小时加热块的显微组织。使用3微升缓冲液为10 NL的显微组织。 通过离心澄清粗提物在16000 XG在18°C下10分钟。裂解物可以在-20℃冷冻储存 5。来样加工混合多达50微升的澄清裂解物用200μlUA中的超滤单元（法医30K）和离心机以14,000×g离心，直到小于10微升的溶液将保留在过滤器中。通常这个步骤需要10-15分钟离心。 吸取200μl的UA的超滤单元与离心机为5.1。空的收集管。 移液管加入50μl的生长素溶液中并在600rpm下在热混合器中混合1分钟并离心在5.1混合。 吸取100微升UA的超滤装置和离心机为5.1。两次重复此步骤吸取100微升的DB到5.1超滤装置和离心。重复此步骤两次。 传送过滤单元，以新的收集管。移液管加入40μlDB用内蛋白酶赖氨酸-C（蛋白酶，以1:100的总蛋白的比例），并混合在600rpm下在热混合器中混合1分钟。在37℃18小时孵育单位在潮湿的腔室中。 离心过滤装置在14,000 XG如5.1。 吸移管160微升的去离子水和离心机的过滤器单元在5.1。汇集流通（5.7和5.8级）包含由内蛋白酶赖氨酸C.释放肽超滤单元转移到新的收集管。加入40微升DB用胰蛋白酶（酶蛋白的比例为1:100），并混合在600rpm下在热混合器中混合1分钟。在37℃下搅拌4小时孵育单位在潮湿的腔室中。重复步骤5.7和5.8收集胰蛋白酶肽。 6。该肽的定量可以在稀释缓冲液中进行的蛋白质酶解肽含量的测定，因为色氨酸残基以及可访问的溶剂。 吸取0.2 ABB毫升到石英比色皿，并记录为“空白”的发射光谱。 使用0.1微克的步骤加入TSS的1微升等分到比色皿和温柔的组合，均采用ABB公司准备校准曲线。 清洁的试管中。 吸取样品并记录光谱（样品）。 计算出的蛋白质和肽浓度的自0.1微克色氨酸对应于约9微克蛋白（基于在b中获得的蛋白质的混合​​物的色氨酸含量的平均值为1.1％Ÿ裂解人体细胞）的蛋白质含量在消化样品或肽含量等于： 其中，F（标准1）为0.1微克色氨酸标准的荧光。该肽含量允许的消化过程的产量计算，并提供必要的信息，下列肽分离和质谱分析。 7。该LYS-C和胰蛋白酶肽分馏通过稀释与消化赖氨酸-C和胰蛋白酶有，0.2毫升BRUB pH值11，pH值5的分别获得肽的解决方案。 组装SAX尖柱的离心管适配器盖。 用0.1ml BRUB，pH值为11的赖氨酸-C pepti分离的含0.1毫升甲醇依次洗涤和平衡的SAX尖柱，0.1毫升1M​​ NaOH和3倍DES和与BRUB，pH值为5的胰蛋白酶肽。溶液通过该柱材料的流动是由离心4000×g下促进。 洗涤和平衡了C 18 – 'StageTips'随后用0.05毫升甲醇中，然后用0.05ml缓冲液B中，并与0.05毫升缓冲液A的制备6-C 18 – 'StageTips'; 4的赖氨酸-分离Ç肽和2的胰蛋白酶肽的分离。 组装SAX提示列在C 18 – 'StageTip“。加载样品溶液进入平衡SAX提示柱和离心柱于5000×g离心3分钟。 平衡的“吸管尖'柱，0.1毫升BRUB的，pH值为11或pH值分别为5到LYC-C和胰蛋白酶样。促进离心5000×g下的流动。 SAX的提示栏转移到下一个C 18 – 'StageTip“。 继续该肽的纯化，用BRUB pH为6，图4和2的赖氨酸C示例，并与BRU乙pH值2与胰蛋白酶肽的样品。对于每一个洗脱步骤使用一个单独的C 18 – 'StageTip“。 用0.05 ml缓冲液A的'StageTips' -洗了C 18 洗脱馏分0.05毫升缓冲液B的成直接用于注射的样品进液相色谱系统装配有质谱仪的小瓶中。