Isolamento, purificação e Rotulagem de neutrófilos da medula óssea do rato de Estudos funcionais e Experimentos de transferência adotiva

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes nos seres humanos. Eles são o principal componente celular do sistema imune inato e agir como uma primeira linha de defesa contra microorganismos invasores. Pacientes com neutropenia adquirida e imunodeficiências primárias que afetam os números de neutrófilos e / ou função desenvolver infecções bacterianas e fúngicas invasoras que ameaçam a vida, destacando a importância dessas células na defesa do hospedeiro ^1. O reconhecimento imunológico dos patogénios invasores no local da infecção pelo seu padrão de reconhecimento de receptores de cognato resulta na indução de uma resposta imune inata orquestrada, o que leva à secreção de quimioatractivos que geram um gradiente quimiotáctica capaz de recrutamento de neutrófilos a partir da corrente sanguínea para o tecido inflamado ² . Depois de introduzir os neutrófilos no local da infecção, eles tornam-se activados, que conduz à produção de citocinas e quimiocinas, absorção de agente patogénico, e me matar através oxidativo e não-oxidativochanisms ^3. Além de seu papel bem reconhecida na imunidade inata, os neutrófilos têm também sido mostrado recentemente a desempenhar papéis importantes como iniciadores da resposta imune adaptativa eficaz ^4. Por outro lado, para além do seu papel na imunidade de protecção, os neutrófilos podem também mediar lesão tecidual e imunopatologia devido à acumulação excessiva e / ou activação em locais de inflamação, como se mostra em uma variedade de doenças infecciosas e auto-imunes ^5-7.

Apesar de o papel indispensável de neutrófilos em montagem respostas imune inata eficazes e suas funções efetoras pleiotrópicos em várias doenças infecciosas e inflamatórias, dificuldades técnicas com a manipulação dessas células ea falta de protocolos experimentais de confiança tem dificultado a pesquisa com neutrófilos nas últimas décadas. Portanto, a utilização de ensaios reprodutíveis para o isolamento dos neutrófilos devem facilitar a investigação sobre neutrófilos mediada imunológicasfunções gica ex vivo e in vivo. Até à data, vários métodos têm sido descritos para o isolamento de neutrófilos, tais como a centrifugação do gradiente de densidade de sangue humano e de rato, ou medula óssea ^8,9, enriquecimento imunomagnética positiva ou negativa dos neutrófilos do sangue ou da medula óssea do rato ^10,11, e colhendo de neutrófilos da cavidade peritoneal de ratinhos a seguir à injecção intraperitoneal de tioglicolato ou outros agentes inflamatórios ^12. Apesar de neutrófilos pode ser facilmente isolado em grande número a partir do sangue humano, este método é de qualidade inferior em ratos devido ao volume limitado de sangue de rato que impede o isolamento de neutrófilos suficientes para estudos funcionais ou experimentos de transferência adotivos ^13. Além disso, embora o rendimento de tioglicolato-induziu as células da cavidade peritoneal é maior comparada com a de rato no sangue, a pureza dos neutrófilos na lavagem peritoneal inflamatória varia entre60-90%, e os neutrófilos isolados apresentam um fenótipo activado. Assim, as células recolhidas utilizando este método só pode ser utilizado para a realização de estudos funcionais activados, mas não de neutrófilos não estimulados, como a cavidade peritoneal do rato tem alguns neutrófilos no estado estacionário ^12. Em vez disso, a medula óssea é um reservatório conveniente para colheita de grandes números de neutrófilos, quer não estimuladas ou ativadas ^11,14, que podem então ser utilizadas para estudos funcionais a jusante, tais como fagocitose, matando e desgranulação, ou por transferência adoptiva em ratinhos receptores.

Aqui nós descrevemos um método simples e rápido (~ 2 horas) protocolo, o que proporciona um alto rendimento (~ 6-12 × 10 ⁶ neutrófilos / mouse não infectado, ou até 30-40 × 10 ⁶ neutrófilos / mouse infectados) de puro (80 -95%) neutrófilos com> 95% de viabilidade a partir da medula óssea. Este método utiliza Histopaque disponíveis comercialmente, que são a densidade de célula separada gradientemeios ração consistindo de Ficoll e diatrizoato de sódio, para separar os neutrófilos a partir da medula óssea de ratinhos. Este método produz números significativamente maiores de neutrófilos por ratinho em comparação com o sangue ou da cavidade abdominal, que pode ser utilizado para recolher os neutrófilos a partir de ratos, tanto no estado estacionário, ou após a infecção, e que é mais fácil a camada de comparação com o método de centrifugação em gradiente de densidade descontínuo que utiliza gradientes de Percoll consistem em 55% / 65% / 75% de Percoll em PBS ^9. Além disso, o tempo e os recursos necessários para recolher neutrófilos puras são significativamente diminuída comparada com o isolamento dos neutrófilos utilizando separação de células activada por fluorescência. Além disso, porque este método não envolve uma etapa de enriquecimento imunomagnética, é mais rentável, e evita a exposição das células à coluna magnética e anticorpos, diminuindo assim a probabilidade de activação de neutrófilos.

Além de realizar estudos funcionais de neutroph isoladoils ex vivo e transferência adoptiva de células em ratinhos receptores, este protocolo também descreve um método para a marcação de neutrófilos isolados, utilizando diferentes corantes CellTracker. Rotulagem diferencial de neutrófilos de ratos de diferentes origens genéticas pode ser adaptado em estudos de repovoamento competitivos para acompanhar os neutrófilos transferidos em tecidos de camundongos destinatário usando citometria de fluxo, o que pode fornecer uma visão mecanicista sobre o papel direto de genes específicos no tráfico de neutrófilos do sangue em órgãos-alvo inflamadas ^6.