La pasivación de la superficie de Estudios sola proteína-molécula

1. Deslice Preparación y limpieza Una cámara de microfluidos se compone de un portaobjetos de cuarzo y un cubreobjetos. En tipo prisma de fluorescencia total reflexión interna (TIRF) microscopía, la superficie del portaobjetos de cuarzo se forma la imagen. Por lo tanto, es importante para limpiar un portaobjetos de cuarzo de fondo usando H 2 O, acetona, KOH, y soluciones piraña. Th es la limpieza de múltiples pasos elimina moléculas orgánicas fluorescentes en una superficie que interfiere con las mediciones de fluorescencia de una sola molécula. Adicionalmente, el grabado de la piraña hace que la superficie hidrófila de cuarzo mediante la generación de grupos hidroxilo. Los grupos hidroxilo libres son esenciales para la reacción amino-silanización en el paso 3. Portaobjetos de cuarzo de perforación. Haga un par de agujeros en una diapositiva de cuarzo con una broca de 3/4 milímetros de perforación de diamante (Figura 2a). Si se desean múltiples canales, perforar más paIRS de agujeros (Figura 2b). Estos agujeros se utilizan para la inyección de soluciones en una cámara de microfluidos en el Paso 7. Mantenga la broca húmedo en H 2 O durante la perforación. H 2 O realiza como un lubricante, lo que aumenta la vida útil de la broca. Ocasional limpiar la punta de la broca ayuda a los agujeros de perforación. Después de la perforación de agujeros, marcar un lado de la corredera para facilitar la identificación durante el proceso de PEGilación. Los marcadores se pueden usar como referencia para evitar la confusión más adelante. Para el marcado, una broca de diamante puede ser utilizado. No utilice ningún bolígrafo ya que la tinta puede ser que consiga en la superficie. Limpieza con H 2 O. Colocar los portaobjetos en una cubeta de tinción de vidrio. Típicamente 5 a 15 diapositivas se pueden colocar en un solo frasco. Enjuagar los portaobjetos con H2O MilliQ Repita 3 veces y sonicar las diapositivas con H2O MilliQ durante 5 minutos para eliminar la suciedad. Deseche el agua y enjuague las diapositivas de nuevo 3 veces conMilliQ H 2 O. Tenga en cuenta que 130 W es la potencia de ultrasonidos utilizado para este protocolo. Potencia de sonicación Superior podría disminuir el tiempo de vida de los portaobjetos de cuarzo. La limpieza con acetona. Vuelva a colocar la MilliQ H 2 O con acetona. Sonicar las diapositivas con acetona durante 20 minutos o más. Enjuague con H 2 O. Deseche la acetona y enjuague los portaobjetos con H2O MilliQ Repetir 3 veces con el fin de eliminar cualquier residuo de acetona. Limpieza con KOH. Cambie el agua con 1 M KOH y sonicar las diapositivas durante 20 minutos o más. Grabado excesivo (por ejemplo, tratamiento de KOH durante la noche) mejorará la calidad de la superficie, pero introducirá arañazos, que podrían interferir con las imágenes de fluorescencia. Enjuague con H 2 O. Enjuagar los portaobjetos con H2O MilliQ por 3 veces para eliminar los rastros de KOH. Grabado Piranha. Transfiera los portaobjetos a un soporte de diapositivas Duran o un soporte de teflón o hechos a medida y plas de ellos en un vaso de precipitados (1 L) que se encuentra en una campana química. Llene el vaso de precipitados con 450 ml de H 2 SO 4. Añadir 150 ml de H 2 O 2 para relación 3:1 entre H 2 SO 4 y H 2 O 2. Una vez que la solución comienza a hervir de manera espontánea, la temperatura aumenta más de 90 º C. Asegúrese de que la solución de H 2 O 2 es a temperatura ambiente antes de iniciar la reacción. De lo contrario, la temperatura de ebullición de la solución puede ser inferior a 90 ° C. Se agita la solución para un mezclado adecuado y dejar que el vaso de precipitados en reposo durante 20 min. Tome las diapositivas de la solución de pirañas, junto con el soporte de diapositivas, y los puso en un soporte de diapositivas que contiene MilliQ H 2 O. Mientras tanto, desechar la solución de pirañas en una botella de residuos designado una vez que alcance la temperatura ambiente. Enjuagar los portaobjetos 3 veces con H2O MilliQ Un cuidado especial se debe tomar con mayor steps para evitar cualquier posible contaminación de las diapositivas. Continuar con el paso 3. Se aconseja proceder de inmediato con los pasos siguientes. * Precaución: La solución de pirañas es extremadamente reactivo. Al manejar esta solución precaución adicional se debe tomar. Además, cuando por error mezclado con disolventes orgánicos tales como acetona, que puede causar una explosión. 2. Limpieza Cubreobjetos Una cámara de microfluidos se compone de un portaobjetos de cuarzo y el labio una cubierta de s. Cuando se utiliza un microscopio TIRF de tipo prisma, la superficie de un cubreobjetos no se forma la imagen. Por lo tanto, es suficiente para limpiar un cubreobjetos sólo con H 2 O y KOH. En caso de que un cubreobjetos debe ser fotografiado (por ejemplo, a través de la microscopía TIRF de tipo objetivo), se recomienda para el tratamiento de los cubreobjetos con solución de pirañas (Paso 1.7). Tenga en cuenta que si la PEGilación de la superficie cubreobjetos no es de alta calidad, que podría actuar como un sumidero para las proteínas de unad dar lugar a variaciones en la concentración de proteína. Enjuague con H 2 O. Coloque los cubreobjetos (24 x 30, 24 x 40, o 24 x 50 mm 2) en un frasco de vidrio de tinción. Típicamente 5 a 15 cubreobjetos se pueden colocar en un solo frasco. Enjuagar los portaobjetos 3 veces con el MilliQ H 2 O. Limpieza con KOH. Cambie el agua con 1 M KOH y sonicar los cubreobjetos durante 20 minutos o más. Enjuague con H 2 O. Enjuagar los portaobjetos 3 veces con H2O MilliQ para eliminar trazas de KOH. Continúe con el paso 3. 3. Amino-silanización de Diapositivas y Cubreobjetos Funcionalización de la superficie de los portaobjetos de cuarzo y los cubreobjetos con grupo amina a través de la química amino-silanización. El metanol se utiliza como un disolvente y ácido acético como catalizador para la reacción de amino-silanización. El enjuague con metanol. Vuelva a colocar la MilliQ H 2 O en los platos de tinción (de Steps 1 y 2) con metanol. Mantenga las diapositivas y los cubreobjetos en metanol hasta el Paso 3.3. No guarde las diapositivas y los cubreobjetos en metanol durante un tiempo innecesariamente largo período de tiempo (por ejemplo, varias horas) ya que las impurezas en metanol absorberá a la superficie. Preparación de solución de amino-silanización. Enjuague un matraz de Pyrex varias veces con metanol. Sonicar el matraz con metanol durante 5 minutos o más. Se recomienda tener un frasco dedicado que se mantiene limpio. Verter 100 ml de metanol en el matraz. Añadir 5 ml de ácido acético. Añadir 3 ml de APTES (trimethoxysilane 3-aminopropil) y mezclar suavemente sacudiéndolo. Amino-silanización. Vuelva a colocar el metanol en los platos de tinción que contienen las diapositivas y los cubreobjetos con la mezcla de reacción aminosilanization. Incubar durante 20 a 30 min. Durante la incubación, sonicar una vez durante 1 min. El enjuague con metanol. Vuelva a colocar la unaminosilanization reacción con metanol. Deseche el metanol y se añade una solución de metanol fresco. Repita este procedimiento tres veces. 4. Pasivación superficial Utilizando Polymer (la primera ronda) Pasivación de la superficie amina recubiertos de portaobjetos de cuarzo y cubreobjetos mediante la conjugación de NHS-éster de polietilenglicol (PEG). Esta reacción se lleva a cabo con la concentración de saturación de la solución de PEG a pH 8,5 durante la noche. Secado de diapositivas y cubreobjetos. Secar los portaobjetos y los cubreobjetos utilizando gas N2 y colocarlos en cajas de pipeta limpia de tal manera que el lado que tiene que ser pegilado quede hacia arriba. El cuadro de pipeta se llena parcialmente con H2O MilliQ Este ambiente húmedo impide solución PEGilación se seque durante la incubación durante la noche. Preparación de tampón de reacción. Preparar 0,1 M de tampón fresco de bicarbonato de sodio (pH 8,5) mediante la disolución de 84 mg de bicarbonato de sodio en 10 ml deMilliQ H 2 O. No hay necesidad de ajustar el pH. Esta solución puede conservarse congelado para el siguiente uso (por ejemplo, el paso 6.1). Preparación de solución de PEGilación. Preparar una mezcla de PEG de 0,2 mg de biotina NHS-éster de PEG (5.000 Da) 13 y 8 mg de éster de NHS de mPEG (5000 Da) en un tubo de 1,5 ml. Al preparar número N de diapositivas, preparar N veces mayor cantidad de la mezcla de PEG en un único tubo. Añadir 64 l (o N Tiempos 64 l de N número de diapositivas) del tampón recién preparado (Paso 4.2). Pipetear hacia arriba y hacia abajo con el fin de disolver completamente. Centrifugar con 16.100 xg durante 1 min para eliminar las burbujas de aire. No pipetear después. De lo contrario, las burbujas de aire se formarán que interfieren con la PEGilación en el Paso 4.4. PEGilación. La gota 70 l de la mezcla de PEGilación a un portaobjetos de cuarzo seca de la Etapa 4.1. Utilice 90 l en el caso de 24 x 50 mm 2 coverslip. Con suavidad, coloque un cubreobjetos secos del Paso 4.1 sobre la solución. Para tener un uniforme y de alta calidad de PEGilación, tenga cuidado de no introducir burbujas de aire. Debido a la tensión superficial, la mayoría de las burbujas de aire puede salir de forma espontánea el volumen de reacción dentro de los cinco minutos, debido a la tensión superficial. Incubar los portaobjetos en un ambiente oscuro y húmedo. La vida media de NHS-éster de PEG que utilizamos a pH 8 es aproximadamente una hora. Como mínimo, los incuban durante 2 horas. Incubación durante la noche conduce a la mayor calidad de PEGilación (datos no mostrados). 5. Almacenamiento a largo plazo El almacenamiento de las diapositivas y cubreobjetos en N 2 pegilado a -20 º C. Secado de diapositivas y cubreobjetos. Desmontar con cuidado el portaobjetos y el cubreobjetos deslizando el cubreobjetos a un lado, enjuagarlos con MilliQ H 2 O, y secarlas con N 2. Almacenamiento de diapositivas y cubreobjetos. For su uso inmediato, siga el procedimiento para la segunda ronda de PEGilación (Paso 6). Con el fin de almacenar por un período largo de tiempo, siga los siguientes pasos. Coloque un par de la corredera y el cubreobjetos en un tubo de 50 ml de tal manera que las superficies PEGilados se enfrentan a distancia el uno del otro. Parcialmente cerrar el tubo de vacío del tubo, y luego llenarlo con N 2. Estos pasos ayudan a preservar la superficie PEGilada durante un largo periodo de tiempo. Atornille el tubo herméticamente y guardarlo a -20 ° C. La calidad de las diapositivas sigue siendo bueno para un máximo de 3 meses (Figura 3a, derecha). 6. Pasivación superficial Utilizando Polymer (La Segunda Ronda) Ronda adicional de PEGilación para hacer la capa más densa PEG y también para apagar cualquier grupos amina restantes en la superficie. El uso de moléculas de éster de NHS de PEG cortos (333 Da) puede ser eficaz en la penetración en una capa de PEG existente. Es recmienda hacer esta segunda ronda de PEGilación derecha antes de usar una diapositiva. Preparación de tampón de reacción. Preparar 0,1 M de tampón de bicarbonato de sodio fresco (pH 8,5). La solución congelada de la Etapa 4.2 también se puede utilizar. Preparación de solución de PEGilación. Disolver 7 l de 250 mM de MS4-PEG en 63 l del tampón de bicarbonato de sodio. PEGilación. Seguir el mismo procedimiento que en el Paso 4.4. Incubar durante 30 min hasta la noche. Secado de diapositivas y cubreobjetos. Desmontar la par de la diapositiva y el cubreobjetos, enjuagarlos con H2O MilliQ, séquelos con N2, y mantenerlos en una caja de pipeta limpia. Proceda para el montaje de una cámara de microfluidos en el Paso 7. 7. Montaje de una cámara de microfluidos Montaje de una cámara de microfluidos usando un par de un portaobjetos de cuarzo pegilado y un cubreobjetos. Cinta adhesiva de doble cara se utiliza como separador. La cámara se sella con pegamento de epoxy y, por loluciones se introducen a través de los agujeros en la corredera de cuarzo. Coloque un portaobjetos de cuarzo sobre una superficie plana con el lado pegilado arriba. Hacer un canal (anchura de 5 a 7 mm) en diagonal sobre la superficie pegilado poniendo cintas adhesivas de doble cara sobre la diapositiva. Asegúrese de que los orificios se colocan en el centro del canal. Tenga cuidado de no estropear la superficie pegilado durante el proceso de fabricación de una cámara. Es posible hacer un portaobjetos de multi-canal mediante la colocación y pegar las cintas adhesivas de doble cara de manera diferente (véase la Figura 2). Con suavidad, coloque un cubreobjetos pegilado en la parte superior para completar la Sala. El lado pegilado debe estar boca abajo. Sellar la cámara pulsando el cubreobjetos sobre el área donde se colocan las cintas de doble cara. Hágalo suavemente pero a fondo para que la cámara se convierte en cerrado de forma estanca el agua. Cierre los bordes de la cámara con pegamento epóxico. Inmovilizar estreptavidina o Neutravidina en lacapa biotinilado de PEG mediante la adición de 50 l de 0,1 mg / ml de solución de estreptavidina o Neutravidina en T50 (Tris-HCl 10 [pH 8,0], 50 mM de NaCl tampón) usando una pipeta P200. Después de 1 min de incubación, lavar con 100 l de tampón T50. Añadir moléculas biológicas con biotina para su imagen de una sola molécula. 8. Deslice Reciclaje Reciclaje de portaobjetos de cuarzo. Diapositivas usados ​​son reciclados por quitarse los cubreobjetos y las cintas adhesivas de doble cara. Después de su uso, guardar las cámaras en el agua del grifo. Incubación a largo plazo en el agua facilita el desmontaje de las cámaras. Hervir las cámaras en el agua del grifo usando un horno de microondas. Utilice un vaso de precipitados Pyrex. Hervir durante 10 minutos o más. Quítese los cubreobjetos y las cintas adhesivas de doble cara utilizando una hoja de afeitar. No presione un portaobjetos de cuarzo perpendicular a su plano. De lo contrario, se rompe. Mantenga la cuchilla de afeitar lejos de la canal. Antiguo Testamentoherwise, introduce arañazos en el canal. Enjuagar los portaobjetos usando un detergente doméstico frotándolos con los dedos. Colocar los portaobjetos en una cubeta de tinción de vidrio. Típicamente 5 a 15 diapositivas se pueden colocar en un solo frasco. Agregar 10% de detergente doméstico y sonicar las diapositivas de 20 minutos o más. Enjuagar los portaobjetos con una gran cantidad de agua del grifo. Vaya al paso 1.2.