Пассивации поверхности для одиночных молекул белка исследований

1. Вставьте подготовка и очистка Микрофлюидных камера состоит из кварцевого горкой и покровного стекла. В призма типа полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) микроскопия, поверхность кварцевой слайд изображается. Таким образом, важно, чтобы очистить кварцевый слайд тщательно с использованием H 2 O, ацетон, KOH, и Piranha решений. Че это многоэтапный очистки исключает флуоресцентные органические молекулы на поверхности, которая мешать измерений одной молекулы флуоресценции. Кроме того, пиранья травление делает поверхность гидрофильной кварц путем генерации гидроксильных групп. Свободные гидроксильные группы необходимы для реакции амино-силанизации в шаге 3. Бурение кварцевые горки. Дрель пару отверстий в кварцевую слайда с 3/4 мм алмаз бурового долота (рис. 2а). Если несколько каналов желании развернуть больше годовыхIRS отверстий (рис. 2б). Эти отверстия используются для инъекционных растворов в микрожидком камеры на шаге 7. Держите сверло мокрые в H 2 O при бурении. H 2 O выполняет роль смазки, что увеличивает срок службы бурового долота. Иногда вытирая кончик бурового долота помогает сверления отверстий. После сверления отверстий, отметьте одну сторону горкой для легкой идентификации в процессе ПЭГилирования. Маркеры могут быть использованы в качестве ссылки, чтобы избежать путаницы в дальнейшем. Для маркировки, алмаз сверло можно использовать. Не используйте ручку с чернилами может получить на поверхности. Очистка с H 2 O. Поместите слайды в окрашивания стеклянной банке. Обычно от 5 до 15 скользит могут быть размещены в одном банке. Промыть слайды с MilliQ H 2 O. Повторите это 3 раза и разрушать ультразвуком слайды с MilliQ H 2 O в течение 5 мин, чтобы удалить грязь. Утилизировать воду и промыть слайды снова 3 разаMilliQ H 2 O. Отметим, что 130 Вт сила ультразвуком используется для этого протокола. Повышенная мощность ультразвуком может уменьшить срок службы кварцевых предметных стеклах. Очистка с помощью ацетона. Замените MilliQ H 2 O с ацетоном. Разрушать ультразвуком слайды с ацетоном в течение 20 мин или дольше. Промывка H 2 O. Откажитесь от ацетон и промыть слайды с MilliQ H 2 O. Повторить 3 раза, чтобы удалить любые остатки ацетон. Очистка с помощью КОН. Замените воду с 1 М КОН и разрушать ультразвуком слайды для 20 мин или дольше. Чрезмерное травления (например, лечение КОН на ночь) повысит качество поверхности, но введет царапины, которые могут помешать флуоресцентных изображений. Промывка H 2 O. Промыть слайды с MilliQ Н 2 О на 3 раза, чтобы удалить следы КОН. Пиранья травления. Перенесите слайды в держатель слайдов Duran или заказ держателя тефлоновой и пласе их в химическом стакане (1 л), который находится в химическом капотом. Заполните стакан с 450 мл H 2 SO 4. Добавить 150 мл H 2 O 2 для 3:01 соотношения H 2 SO 4 и H 2 O 2. Как только раствор закипит спонтанно, повышением температуры более 90 ° С. Убедитесь в том, что решение Н 2 О 2 является при комнатной температуре перед началом реакции. В противном случае, температура кипения раствора может быть ниже 90 ° С. Раствор перемешивают в течение правильного смешивания и пусть стакан спокойно в течение 20 мин. Возьмите слайды из пираний растворе вместе с держателя слайдов, и поместить их в держатель слайдов, содержащего MilliQ H 2 O. Между тем, отказаться от пираньи решение в назначенный бутылки отходов как только он достигнет комнатной температуры. Промыть слайды 3 раза MilliQ H 2 O. Особую осторожность должны быть приняты в дальнейшем степс, чтобы избежать любого возможного загрязнения слайдов. Перейдите к шагу 3. Рекомендуется незамедлительно приступить к следующим шагам. * Внимание: Решение пираньи чрезвычайно реактивным. При работе с этим решение дополнительная следует проявлять осторожность. Кроме того, когда по ошибке, смешанного с органических растворителей, таких как ацетон, это может привести к взрыву. 2. Покровные очистки Микрофлюидных камера состоит из кварцевого горкой и губы крышку с. При использовании призмы типа TIRF микроскоп, поверхность покровным не отображены. Таким образом, это достаточно, чтобы очистить покровное только с Н 2 О и КОН. В случае, если покровное должна быть отображены (например, через цель типа TIRF микроскопии), рекомендуется для лечения покровные с пираньи решения (этап 1.7). Заметим, что если ПЭГилирование поверхности покровного не высокого качества, оно может действовать в качестве поглотителя белковг порождают различия в концентрации белка. Промывка H 2 O. Место покровные (24 х 30, 24 х 40 или 24 х 50 мм 2) в окрашивания стеклянной банке. Обычно от 5 до 15 покровные могут быть размещены в одном банке. Промыть покровные 3 раза с MilliQ H 2 O. Очистка с помощью КОН. Замените воду 1М КОН и разрушать ультразвуком покровные в течение 20 мин или дольше. Промывка H 2 O. Промыть покровные 3 раза MilliQ H 2 O для удаления следов КОН. Перейдите к шагу 3. 3. Амино-силанизация слайдов и покровные Функционализации поверхности кварцевых предметных стеклах и покровные с аминогруппой с помощью химии амино-силанизация. Метанол используется в качестве растворителя и уксусной кислоты в качестве катализатора для реакции амино-силанизация. Промывка метанолом. Замените MilliQ H 2 O в окрашивания блюд (от SТЭЦ 1 и 2) метанолом. Хранить слайды и покровные в метаноле до шаге 3.3. Не хранить горки и покровные в метаноле в течение неоправданно длительного периода времени (например, несколько часов) с примесей в метаноле будет адсорбироваться на поверхности. Подготовка амино-силанизации решение. Промыть пайрексовой колбе несколько раз метанолом. Обрабатывают ультразвуком колбу с метанолом в течение 5 мин или дольше. Он сообщил, иметь специальный сосуд, который поддерживается в чистоте. Налейте 100 мл метанола в колбу. Добавляют 5 мл уксусной кислоты. Добавьте 3 мл APTES (3-аминопропилтриметоксисилан) и аккуратно перемешать, встряхивая его. Амино-силанизация. Замените метанола в окрашивания блюд, которые содержат слайды и покровные с реакционной aminosilanization смеси. Инкубировать в течение 20-30 мин. Во время инкубации, разрушать ультразвуком раз в течение 1 мин. Промывка метанолом. Замените AРеакция minosilanization метанолом. Отменить метанола и добавить свежий раствор метанола. Повторите эту процедуру три раза. 4. Пассивации поверхности Использование полимера (первый раунд) Пассивации амина покрытием поверхности кварцевых предметных стеклах и покровные путем конъюгации NHS-эфира полиэтиленгликоля (ПЭГ). Эта реакция осуществляется с насыщающей концентрацией ПЭГ растворе при рН 8,5 в течение ночи. Сушка горки и покровные. Высушите горки и покровные, используя N 2 газ и разместить их в чистых пипеток коробки таким образом, чтобы сторона, которая должна быть ПЭГилированный вверх. Пипетка коробка частично заполнен MilliQ H 2 O. Это влажная среда предотвращает ПЭГилирование решение от высыхания во время инкубации в течение ночи. Подготовка буфера реакции. Подготовка 0,1 М бикарбоната натрия свежего буфера (рН 8,5) путем растворения 84 мг бикарбоната натрия в 10 млMilliQ H 2 O. Там нет необходимости корректировки рН. Этот раствор можно хранить в замороженном виде следующего использования (например, на стадии 6.1). Подготовка ПЭГилирование решение. Приготовить смесь ПЭГ 0,2 мг биотинилированных NHS-эфир ПЭГ (5000 Да) 13 и 8 мг NHS-эфира MPEG (5000 Да) в 1,5 мл трубки. При подготовке N количество слайдов, готовить N раз большее количество смеси ПЭГ в одной пробирке. Добавить 64 мкл (или N раз 64 мкл для N количество слайдов) свежеприготовленного буфера (Шаг 4.2). Внесите его вверх и вниз, чтобы растворить их полностью. Центрифуга с 16100 мкг в течение 1 мин для удаления пузырьков воздуха. Не пипетки впоследствии. В противном случае, пузырьки воздуха сформируют которые препятствуют ПЭГилирования на шаге 4.4. ПЭГилирование. Оставьте 70 мкл ПЭГилирования смеси высушенной кварцевого слайда с шага 4.1. Используйте 90 мкл в случае 24 х 50 мм 2 соуerslip. Аккуратно поместите высушенный покровное с шага 4.1 над раствором. Чтобы иметь форму и высокое качество ПЭГилирования, заботиться, чтобы не вводить пузырьков воздуха. В связи с поверхностным натяжением, большинство воздушных пузырьков может спонтанно оставить объем реакционной смеси в течение пяти минут благодаря поверхностному натяжению. Инкубируйте слайды в темном и влажной среде. Период полураспада NHS-эфира PEG, которые мы используем при рН 8 составляет около одного часа. Как минимум, инкубировать их в течение 2 часов. Инкубации в течение ночи приводит к более высокому качеству ПЭГилированием (данные не показаны). 5. Долговременное хранение Хранение слайды Пегилированный и покровные в N 2 при температуре -20 ° С. Сушка горки и покровные. Тщательно разобрать горка и покровное, сдвинув покровное боку, промойте их MilliQ H 2 O, и высушите их с N 2. Хранение горки и покровные. Фог немедленного использования, выполните процедуру для второго тура ПЭГилирования (шаг 6). Для того чтобы хранить в течение более длительного периода времени, выполните следующие шаги. Поместите пару ползуна и покровное в 50 мл пробирку так, чтобы поверхности ПЭГилированные сталкиваются друг от друга. Частично закрыть трубу, вакуумные трубки, а затем заполнить его с N 2. Эти шаги помогают сохранению поверхность пегилированного в течение длительного периода времени. Винт трубку плотно и хранить его при температуре -20 ° С. Качество слайдов остается хорошим на срок до 3 месяцев (рис. 3, справа). 6. Пассивации поверхности Использование полимера (второй тур) Дополнительная раунд ПЭГилирования чтобы сделать слой плотнее PEG, а также, чтобы утолить все оставшиеся аминогруппы на поверхности. Использование коротких молекул NHS-эфир ПЭГ (333 Да) может быть эффективным в проникновении в существующую ПЭГ слоя. Это рекомендациядуется, чтобы сделать эту второй раунд ПЭГилирования прямо перед использованием слайд. Подготовка буфера реакции. Подготовка 0,1 М бикарбоната натрия свежего буфера (рН 8,5). Замороженный раствор, полученный на стадии 4.2, также могут быть использованы. Подготовка ПЭГилирование решение. Растворить 7 мкл 250 мМ MS4-PEG в 63 мкл буфера бикарбоната натрия. ПЭГилирование. Выполните ту же процедуру, как в шаге 4.4. Инкубировать 30 мин до в течение ночи. Сушка горки и покровные. Разберите пару слайде и покровное, промойте их MilliQ H 2 O, высушить их с N 2, и держать их в чистом поле пипетки. Перейдите по сборке микрофлюидных камеру в шаге 7. 7. Сборка микрофлюидном палату Сборка микрофлюидных камеру, используя пару кварцевой слайд ПЭГилированного и покровное. Двусторонняя липкая лента используется в качестве прокладки. Герметизации камеры эпоксидным клеем и, таким образом,lutions вводятся через отверстия в кварцевой слайда. Наведите кварцевый слайд на плоской поверхности, чтобы сторона ПЭГилированный вверх. Сделать канал (ширина от 5 до 7 мм) по диагонали на поверхности ПЭГилированного, поставив двусторонние липкие ленты на слайде. Убедитесь, что отверстия расположены в центре канала. Позаботьтесь, чтобы не испортить поверхность Пегилированный в процессе принятия камеру. Это можно сделать многоканальный слайд с путем размещения и приклеить двухсторонний липкие ленты-разному (см. рисунок 2). Аккуратно поместите покровное Пегилированный на вершине, чтобы завершить камеру. Боковая ПЭГилированный должна быть обращена вниз. Закройте камеру, нажав покровное над районом, где двусторонние ленты размещены. Сделайте это осторожно, но тщательно, так что камера становится водой плотно закрытыми. Закройте края камеры эпоксидным клеем. Остановите Стрептавидин или Neutravidin набиотинилированный PEG слой добавлением 50 мкл 0,1 мг / мл стрептавидина или Neutravidin раствора в Т50 (10 мМ Трис-HCl [pH 8,0], 50 мМ буфера NaCl) с использованием P200 пипетки. Через 1 мин инкубации на одном уровне с 100 мкл буфера T50. Добавить биотинилированных биологических молекул для работы с изображениями вашего одиночных молекул. 8. Вставьте Переработка Переработка кварцевые слайды. Подержанные горки перерабатываются, сняв покровные и двухсторонние липкие ленты. После использования хранить камеры в водопроводной воде. Долгосрочный инкубации в воде облегчает разборку камер. Отварить камеры в водопроводной воде с использованием микроволновой печью. Используйте стакан Pyrex. Варить в течение 10 мин или дольше. Взлетел покровные и двухсторонние липкие ленты, используя лезвие бритвы. Не нажимайте кварцевый слайд перпендикулярно ее плоскости. В противном случае, он ломает. Держите лезвие от канала. Ветхий Заветherwise, он вводит царапин на канале. Промыть слайды, используя бытовое моющее средство, потерев их пальцами. Поместите слайды в окрашивания стеклянной банке. Обычно от 5 до 15 скользит могут быть размещены в одном банке. Добавить 10% бытовое моющее средство и разрушать ультразвуком слайды для 20 мин или дольше. Промыть слайды с большим количеством вкладок воды. Переходите к этапу 1.2.