Passivazione della superficie per singola molecola proteica Studi

1. Scorrere Preparazione e pulizia Una camera di microfluidica è composto di una diapositiva quarzo e un coprioggetto. In prisma di tipo a riflessione totale interna fluorescenza (TIRF) microscopia, la superficie del vetrino di quarzo viene esposta. Pertanto, è importante pulire una diapositiva quarzo accuratamente con H 2 O, acetone, KOH, e soluzioni Piranha. Th è pulizia multi-step elimina molecole organiche fluorescenti su una superficie che interferiscono con le singole misure di fluorescenza della molecola. Inoltre, l'attacco piranha rende la superficie idrofila quarzo generando gruppi idrossilici. I gruppi idrossilici liberi sono essenziali per la reazione ammino-silanizzazione nel passaggio 3. Diapositive quarzo Drilling. Praticare un paio di fori in una diapositiva quarzo con un bit 3/4 mm punta di diamante (Figura 2a). Se si desiderano più canali, forare più pairs di fori (Figura 2b). Questi fori servono per iniettare soluzioni in una camera microfluidica nel passaggio 7. Mantenere la punta bagnata in H 2 O durante la perforazione. H 2 O esegue come lubrificante, che aumenta la durata della punta. Occasionali asciugandosi la punta del trapano aiuta fori. Dopo fori, segnare un lato del vetrino per una facile identificazione durante il processo di PEGylation. I marcatori possono essere utilizzati come riferimento per evitare confusione in seguito. Per la marcatura, una punta di diamante può essere utilizzato. Non utilizzare la penna in quanto l'inchiostro potrebbe ottenere sulla superficie. Pulizia con H 2 O. Porre i vetrini in una vaschetta di colorazione di vetro. Tipicamente 5 a 15 vetrini possono essere collocati in un singolo barattolo. Sciacquare i vetrini con MilliQ H 2 O. Ripetere 3 volte e sonicare i vetrini con MilliQ H 2 O per 5 minuti per rimuovere lo sporco. Smaltire l'acqua e sciacquare gli scivoli di nuovo 3 volte conMilliQ H 2 O. Si noti che 130 W è la potenza sonicazione utilizzato per questo protocollo. Potenza sonicazione superiore potrebbe diminuire la durata delle diapositive di quarzo. Pulizia con acetone. Sostituire il MilliQ H 2 O con acetone. Sonicare i vetrini con acetone per 20 minuti o più. Risciacquo con H 2 O. Eliminare il acetone e lavare i vetrini con MilliQ H 2 O. Ripetere per 3 volte per rimuovere eventuali residui di acetone. Pulizia con KOH. Sostituire l'acqua con 1 M KOH e sonicare le diapositive per 20 minuti o più a lungo. Incisione eccessivo (ad esempio di notte trattamento KOH) migliorerà la qualità della superficie, ma introdurrà graffi, che potrebbero interferire con fluorescenza. Risciacquo con H 2 O. Risciacquare i vetrini con MilliQ H 2 O per 3 volte per rimuovere tracce di KOH. Piranha incisione. Trasferire i vetrini in un portavetrini Duran o un titolare di Teflon misura e plli ace in un becher (1 L) che si trova in una cappa chimica. Riempire il bicchiere con 450 ml di H 2 SO 4. Aggiungere 150 ml di H 2 O 2 in rapporto 3:1 tra H 2 SO 4 e H 2 O 2. Una volta che la soluzione inizia a bollire spontaneamente, la temperatura aumenta oltre 90 ° C. Assicurarsi che la soluzione di H 2 O 2 è a temperatura ambiente prima di iniziare la reazione. In caso contrario, la temperatura di ebollizione della soluzione può essere inferiore a 90 ° C. Agitare la soluzione per una corretta miscelazione e lasciare il becher indisturbato per 20 min. Prendete le diapositive dalla soluzione piranha insieme con il supporto per diapositive, e metterli in un supporto diapositiva contenente MilliQ H 2 O. Nel frattempo, scartare la soluzione piranha in una bottiglia di scarico designata, una volta raggiunta la temperatura ambiente. Risciacquare i vetrini 3 volte con MilliQ H 2 O. La cura supplementare dovrebbe essere presa in ulteriore steps per evitare ogni possibile contaminazione dei vetrini. Continua al punto 3. Si consiglia di procedere immediatamente con le seguenti operazioni. * Attenzione: La soluzione piranha è estremamente reattivo. Quando si maneggia questa soluzione estrema cautela dovrebbe essere presa. Inoltre, quando per errore miscelato con solventi organici come acetone, può causare esplosioni. 2. Pulizia Coverslip Una camera di microfluidica è composto di una diapositiva quarzo e un labbro coperchio s. Quando viene usato un microscopio TIRF prisma-tipo, la superficie di un vetrino non viene esposta. Pertanto, è sufficiente pulire un coprioggetto solo con H 2 O e KOH. Nel caso un coprioggetto deve essere ripreso (ad esempio attraverso l'obiettivo di tipo microscopia TIRF), si raccomanda di trattare i coprioggetti con soluzione Piranha (Passo 1.7). Si noti che se PEGylation della superficie coprioggetto non è di alta qualità, potrebbe agire come un dissipatore di proteine ​​per und dar luogo a variazioni della concentrazione proteica. Risciacquo con H 2 O. Inserire coprioggetto (24 x 30, 24 x 40 o 24 x 50 mm 2) in una vaschetta di colorazione vetro. Tipicamente 5 a 15 coprioggetto può essere collocato in un vaso singolo. Lavare i coprioggetti 3 volte con il MilliQ H 2 O. Pulizia con KOH. Sostituire l'acqua con KOH 1M e sonicare le lamelle per 20 minuti o più a lungo. Risciacquo con H 2 O. Lavare i coprioggetti 3 volte con MilliQ H 2 O per rimuovere tracce di KOH. Passare alla fase 3. 3. Amino-silanizzazione di diapositive e Coprivetrini Funzionalizzazione della superficie dei vetrini quarzo e il coprioggetto con gruppo amminico tramite la chimica ammino-silanizzazione. Il metanolo viene usato come solvente e acido acetico come catalizzatore per la reazione ammino-silanizzazione. Risciacquo con metanolo. Sostituire il MilliQ H 2 O nei piatti di colorazione (da SPTO 1 e 2) con metanolo. Mantenere le diapositive e le coprioggetto in metanolo fino al punto 3.3. Non conservare i vetrini e coprioggetto in metanolo per un inutilmente lungo periodo di tempo (ad esempio alcune ore) da impurezze in metanolo adsorbire alla superficie. Preparare una soluzione amino-silanizzazione. Risciacquare una beuta Pyrex più volte con metanolo. Sonicare il pallone con metanolo per 5 minuti o più. Si consiglia di avere un pallone dedicato che viene mantenuta pulita. Versare 100 ml di metanolo nel pallone. Aggiungere 5 ml di acido acetico. Aggiungere 3 ml di APTES (3 amminopropil trimetossisilano) e mescolare delicatamente agitandolo. Amino-silanizzazione. Sostituire il metanolo nei piatti di colorazione che contengono le diapositive e il coprioggetto con la miscela di reazione aminosilanization. Incubare per 20-30 min. Durante l'incubazione, sonicare volta per 1 min. Risciacquo con metanolo. Sostituire l'unareazione minosilanization con metanolo. Eliminare il metanolo e aggiungere una soluzione di metanolo fresco. Ripetere questa procedura per tre volte. 4. Passivazione della superficie Uso Polymer (al primo turno) Passivazione della superficie ammina rivestita di diapositive di quarzo e coprioggetto coniugando NHS-estere polietilene glicole (PEG). Questa reazione viene condotta con la concentrazione di saturazione della soluzione di PEG a pH 8.5 notte. Asciugatura diapositive e lamelle. Asciugare le diapositive e le coprioggetti con N 2 gas e metterli in scatole pipetta puliti in modo tale che il lato che deve essere PEGylated è rivolto verso l'alto. La scatola pipetta è parzialmente riempita con MilliQ H 2 O. Questo ambiente umido impedisce soluzione PEGylation si secchi durante la notte di incubazione. Preparazione del tampone di reazione. Preparare 0,1 M di tampone fresco bicarbonato di sodio (pH 8,5) sciogliendo 84 mg di bicarbonato di sodio in 10 ml diMilliQ H 2 O. Non c'è bisogno di regolazione del pH. Questa soluzione può essere conservata congelata per l'uso successivo (ad es Fase 6.1). Preparazione soluzione PEGylation. Preparare una miscela di 0,2 mg PEG biotinilato NHS-estere PEG (5.000 Da) 13 e 8 mg di NHS-estere mPEG (5.000 Da) in una provetta da 1,5 ml. Nel preparare numero N di diapositive, preparare N volte più grande quantità della miscela PEG in un unico tubo. Aggiungere 64 ml (o N volte 64 microlitri per numero N di diapositive) del buffer appena preparato (punto 4.2). Pipettare su e giù per sciogliere completamente. Centrifuga con 16.100 xg per 1 minuto per eliminare le bolle d'aria. Non pipettare dopo. In caso contrario, le bolle d'aria si formano che interferiscono con PEGylation al punto 4.4. PEGylation. Goccia 70 ml di miscela PEGylation a una diapositiva quarzo essiccata dal punto 4.1. Utilizzare 90 ml nel caso di 24 x 50 mm 2 coverslip. Inserire delicatamente un vetrino asciugato dal punto 4.1 sopra la soluzione. Per avere un uniforme e di alta qualità di PEGylation, fare attenzione a non introdurre bolle d'aria. A causa di tensione superficiale, la maggior parte delle bolle d'aria possono spontaneamente lasciare il volume di reazione entro cinque minuti a causa della tensione superficiale. Incubare i vetrini in un ambiente buio e umido. L'emivita di NHS-estere PEG che usiamo a pH 8 è circa un'ora. Come minimo, li incubare per 2 ore. Notte di incubazione porta alla più elevata qualità di PEGylation (dati non mostrati). 5. Conservazione a lungo termine Memorizzazione delle diapositive pegilato e coprioggetto in N 2 a -20 ° C. Asciugatura diapositive e lamelle. Disassemblare con cura il vetrino ed il coprioggetto facendo scorrere il vetrino ad un lato, sciacquare con MilliQ H 2 O, e asciugarle con N 2. Memorizzazione di diapositive e lamelle. For uso immediato, seguire la procedura per il secondo turno di PEGylation (punto 6). Al fine di conservare per un periodo di tempo più lungo, seguire i passi successivi. Posizionare una coppia del vetrino e coprioggetto in un tubo da 50 ml tale che le superfici siano rivolti PEGilate distanti. Parzialmente chiudere il tubo, aspirare il tubo, e poi riempirlo con N 2. Questi passaggi aiutano preservare la superficie PEGylated per un lungo periodo di tempo. Avvitare il tubo ermeticamente e conservarlo a -20 ° C. La qualità delle diapositive rimane buona per 3 mesi (Figura 3a, destra). 6. Passivazione della superficie Uso Polymer (secondo turno) Ulteriori giro di PEGylation per rendere lo strato più denso PEG e anche per estinguere eventuali gruppi amminici rimanenti sulla superficie. L'uso di brevi molecole NHS-estere PEG (333 Da) può essere efficace a penetrare in uno strato PEG esistente. E 'recmanda di fare questo secondo round di PEGylation destra prima di utilizzare una diapositiva. Preparazione del tampone di reazione. Preparare 0,1 M di tampone fresco bicarbonato di sodio (pH 8,5). La soluzione congelata dal punto 4.2 può anche essere usato. Preparazione soluzione PEGylation. Sciogliere 7 ml di 250 mM MS4-PEG in 63 ml di tampone bicarbonato di sodio. PEGylation. Seguire la stessa procedura della Fase 4.4. Incubare per 30 min fino a tutta la notte. Asciugatura diapositive e lamelle. Smontare la coppia di slitta e il vetrino, sciacquare con MilliQ H 2 O, asciugarle con N 2, e tenerli in una scatola pipetta pulita. Procedere per l'assemblaggio di una camera di microfluidica al punto 7. 7. Assemblare una sezione Microfluidic Assemblare una camera microfluidica utilizzando una coppia di quarzo diapositiva PEGylated e un copri. Nastro biadesivo appiccicoso viene utilizzato come spaziatore. La camera è sigillata con colla epossidica e, cosìluzioni vengono introdotte attraverso i fori della diapositiva quarzo. Posizionare un vetrino di quarzo su una superficie piana con il lato PEGylated rivolto verso l'alto. Effettuare un canale (larghezza 5 a 7 mm) in diagonale sulla superficie PEGylated mettendo nastri biadesivi appiccicose sul vetrino. Assicurarsi che i fori sono posizionati al centro del canale. Fare attenzione a non rovinare la superficie PEGylated durante il processo di creazione di una camera. E 'possibile effettuare una diapositiva multi-canale, inserendo e attaccare i nastri biadesivi appiccicose diverso (vedere Figura 2). Posizionare delicatamente un coprioggetto PEGylated sulla parte superiore per completare la stanza. Il lato PEGylated deve essere rivolto verso il basso. Sigillare la camera premendo il vetrino sopra la zona dove si trovano i nastri su due lati. Fatelo delicatamente, ma accuratamente in modo che la camera diventa acqua ermeticamente chiusi. Chiudere i bordi della camera con colla epossidica. Immobilizzare Streptavidina o neutravidina sulPEG biotinilato strato aggiungendo 50 ml di 0,1 mg / ml di soluzione di streptavidina o NeutrAvidin a T50 (10 mM Tris-HCl [pH8.0], 50 mM tampone NaCl) usando una pipetta p200. Dopo 1 min di incubazione, lavare con 100 microlitri di tampone T50. Aggiungi molecole biologiche biotinilati per la vostra rappresentazione singola molecola. 8. Scorrere Recycling Riciclaggio diapositive quarzo. Vetrini usati sono riciclati togliendo i coprioggetti e nastri a doppia faccia appiccicoso. Dopo l'uso, conservare le camere in acqua di rubinetto. Incubazione lungo termine in acqua facilita lo smontaggio delle camere. Lessare le camere in acqua di rubinetto utilizzando un forno a microonde. Utilizzare un bicchiere Pyrex. Bollire per 10 minuti o più. Togliere i coprioggetti e nastri a doppia faccia appiccicose con una lama di rasoio. Non premere una diapositiva quarzo perpendicolare al suo piano. In caso contrario, si rompe. Mantenere la lametta dal canale. Otherwise, introduce graffi sul canale. Sciacquare i vetrini utilizzando un detergente per uso domestico da sfregamento con le dita. Porre i vetrini in una vaschetta di colorazione di vetro. Tipicamente 5 a 15 vetrini possono essere collocati in un singolo barattolo. Aggiungere 10% detergenti per la casa e sonicare le diapositive per 20 minuti o più a lungo. Sciacquare i vetrini con una grande quantità di acqua tab. Passare al punto 1.2.