Oberflächenpassivierung für Einzelmolekül-Protein Studies

1. Schieben Vorbereitung und Reinigung Mikrofluidkammer aus einem Quarz-Objektträger und einem Deckglas besteht. Prismenartigen inneren Totalreflexion (TIRF)-Mikroskopie, wird die Oberfläche des Objektträgers abgebildet. Daher ist es wichtig, eine Quarz-Objektträger gründlich mit H 2 O, Aceton, KOH und Piranha-Lösung gereinigt werden. Th mehrstufige Reinigung beseitigt fluoreszierenden organischen Molekülen auf einer Oberfläche, die mit Einzelmolekülfluoreszenzmessungen beeinträchtigen. Darüber hinaus macht der Piranha Ätzen der Quarzoberfläche hydrophil durch Erzeugung Hydroxylgruppen. Die freien Hydroxylgruppen sind für die Amino-Silanisierung Reaktion in Schritt 3. Bohren Quarz Rutschen. Bohren Sie ein Paar Löcher in eine Quarz-Objektträger mit einer 3/4 mm Diamantbohrer (Abbildung 2a). Wenn mehrere Kanäle gewünscht werden, bohren mehr pairs von Löchern (Abbildung 2b). Diese Löcher sind zum Einspritzen von Lösungen in einer mikrofluidischen Kammer in Schritt 7 verwendet. Halten Sie den Bohrer nass in H 2 O während des Bohrens. H 2 O führt als Schmiermittel, wodurch die Lebensdauer des Bohrers erhöht. Gelegentliche Wischen Sie die Spitze des Bohrers hilft Bohren von Löchern. Nach dem Bohren, Markieren einer Seite der Folie zur einfachen Identifizierung während der PEGylierung Prozess. Die Marker können als Referenz verwendet werden, um spätere Verwirrung zu vermeiden. Zur Kennzeichnung kann ein Diamant-Bohrer verwendet werden. Verwenden Sie keine Kugelschreiber da die Tinte könnte auf der Oberfläche zu erhalten. Reinigung mit H 2 O. Objektträger in einem Glas Küvette. Typischerweise 5 bis 15 gleitet in einem einzigen Gefäß gegeben werden. Mit MilliQ H 2 O. Spülen Sie die Folien Wiederholen Sie es 3 Mal und beschallen die Folien mit MilliQ H 2 O für 5 Minuten, um Schmutz zu entfernen. Entsorgen Sie das Wasser und spülen Sie die Folien wieder 3 mal mitMilliQ H 2 O. Hinweis, dass 130 W ist die Beschallungsleistung für dieses Protokoll verwendet. Höhere Beschallungsleistung könnte die Lebensdauer der Quarz-Objektträger zu verringern. Reinigung mit Aceton. Ersetzen Sie die MilliQ H 2 O mit Aceton. Beschallen Sie die Folien mit Aceton für 20 Minuten oder länger. Spülen mit H 2 O. Entsorgen Sie die Aceton und spülen Sie die Folien mit MilliQ H 2 O. Wiederholung für 3-mal, um jegliche Rückstände zu entfernen Aceton. Reinigung mit KOH. Ersetzen Sie das Wasser mit 1 M KOH und beschallen die Objektträger für 20 Minuten oder länger. Übermäßige Ätzen (z. B. über Nacht KOH-Behandlung) wird die Qualität der Oberfläche zu verbessern, wird aber Kratzer, die mit Fluoreszenz-Bildgebung stören könnten einzuführen. Spülen mit H 2 O. Spülen Sie die Folien mit MilliQ H 2 O 3-mal, um Spuren von KOH zu entfernen. Piranha Ätzen. Die Objektträger in eine Duran Trägerhalter oder einem maßgeschneiderten Teflon Halter und place sie in einen Becher (1 L), die in einer chemischen Haube befindet. Das Becherglas wird mit 450 ml H 2 SO 4. Mit 150 ml H 2 O 2 für 3:1-Verhältnis zwischen H 2 SO 4 und H 2 O 2. Sobald die Lösung beginnt zu sieden spontan erhöht über 90 ° C die Temperatur Sicherstellen, dass die H 2 O 2-Lösung bei Raumtemperatur vor dem Starten der Reaktion. Ansonsten kann die Temperatur der siedenden Lösung niedriger als 90 ° C sein Rühren Sie die Lösung für die richtige Mischung und lassen Sie das Becherglas ungestört für 20 min. Nehmen Sie die Folien aus dem Piranha-Lösung zusammen mit dem Trägerhalter, und steckte sie in einen Objektträgerhalter enthält MilliQ H 2 O. Unterdessen werfen Sie die Piranha-Lösung in einem bestimmten Abfallflasche, wenn es Zimmertemperatur erreicht. Mit MilliQ H 2 O spülen Sie die Folien 3 mal Besondere Sorgfalt sollte in weiteren ste genommen werdenps, um jede mögliche Verunreinigung der Folien zu vermeiden. Fahren Sie mit Schritt 3 fort. Es wird empfohlen, sofort mit den folgenden Schritten fortfahren. * Achtung: Das Piranha-Lösung ist äußerst reaktiv. Beim Umgang mit dieser Lösung sollte besondere Vorsicht eingenommen werden. Darüber hinaus, wenn aus Versehen mit organischen Lösungsmitteln wie Aceton vermischt, kann es zu einer Explosion führen. 2. Coverslip Reinigung Ein mikrofluidischen Kammer besteht aus einem Quarz-Objektträger und eine Abdeckung s Lippe zusammen. Wenn ein TIRF-Mikroskop Prismentyp verwendet wird, wird die Oberfläche eines Deckglases nicht abgebildet. Daher ist es ausreichend, ein Deckglas nur mit H 2 O und KOH reinigen. Im Falle muss ein Deckglas abgebildet werden (zB über das Ziel-Typ-TIRF-Mikroskopie), empfiehlt es sich, die Deckgläser mit Piranha-Lösung (Schritt 1.7) zu behandeln. Beachten Sie, dass, wenn PEGylation der Deckfläche ist nicht von hoher Qualität, könnte es als Senke für Proteine ​​wirken eind zu Schwankungen in der Proteinkonzentration zu ergeben. Spülen mit H 2 O. Platz Deckgläsern (24 x 30, 24 x 40 oder 24 x 50 mm 2) in einem Glas Küvette. Typischerweise 5 bis 15 Deckgläser in einem einzigen Gefäß gegeben werden. Mit MilliQ H 2 O spülen Sie die Deckgläser 3 mal Reinigung mit KOH. Ersetzen Sie das Wasser mit 1 M KOH und beschallen die Deckgläser für 20 Minuten oder länger. Spülen mit H 2 O. Spülen Sie die Deckgläschen 3 mal mit MilliQ H 2 O, um Spuren von KOH zu entfernen. Fahren Sie mit Schritt 3 fort. 3. Amino-Silanisierung von Folien und Deckgläser Funktionalisieren der Oberfläche des Quarzobjektträger und Deckgläser mit Amingruppe über die Amino-Silanisierung Chemie. Methanol wird als Lösungsmittel und Essigsäure als Katalysator für die Amino-Silanisierung Reaktion verwendet. Spülen mit Methanol. Ersetzen Sie die MilliQ H 2 O in der Färbung Gerichte (ab STEPs 1 und 2) mit Methanol. Halten Sie die Folien und die Deckgläser in Methanol bis Schritt 3.3. Da Verunreinigungen in Methanol die Folien und die Deckgläser in Methanol für eine unnötig lange Zeit (zB mehrere Stunden) lagern an die Oberfläche zu adsorbieren. Vorbereiten Amino-Silanisierung Lösung. Ein Pyrex-Kolben mehrmals mit Methanol spülen. Beschallen der Kolben mit Methanol für 5 min oder länger. Es wird empfohlen, einen dedizierten Kolben, die sauber gehalten wird, zu haben. Werden 100 ml Methanol in den Kolben. 5 ml Essigsäure. 3 ml APTES (3-Aminopropyltrimethoxysilan) und vorsichtig durch Schütteln. Amino-Silanisierung. Ersetzen Sie das Methanol in den Gerichten, die Färbung der Objektträger und Deckgläser mit dem Aminosilanisierung Reaktionsgemisch enthalten. Inkubation für 20-30 min. Während der Inkubation beschallen einmal für 1 min. Spülen mit Methanol. Ersetzen Sie die eineminosilanization Reaktion mit Methanol. Entsorgen Sie die Methanol und fügen Sie eine neue Methanollösung. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal. 4. Oberflächenpassivierung Verwendung von Polymer (Die erste Runde) Passivieren der Amin-beschichtete Oberfläche des Quarzobjektträger und Deckgläser durch Konjugation von NHS-Ester Polyethylenglykol (PEG). Diese Reaktion wird mit der Sättigungskonzentration der PEG-Lösung bei pH 8,5 über Nacht durchgeführt. Trocknen Rutschen und Deckgläser. Trocknen der Objektträger und Deckgläser unter Verwendung von N 2-Gas und sie in saubere Pipettenkästen in einer Weise, dass die Seite, die zu sein PEGylierten nach oben weist. Die Pipette Feld ist teilweise mit MilliQ H 2 O gefüllt Dies verhindert, dass feuchte Umgebung PEGylation Lösung vor dem Austrocknen während der Inkubation über Nacht. Vorbereiten Reaktionspuffer. Vorbereitung der frischen 0,1 M Natriumbicarbonat-Puffer (pH 8,5) durch Auflösen von 84 mg Natriumbicarbonat in 10 mlMilliQ H 2 O. Es besteht keine Notwendigkeit der Einstellung des pH. Diese Lösung kann für den nächsten Einsatz (zB Step 6.1) eingefroren gelagert werden. Vorbereiten PEGylation Lösung. Vorbereitung einer Mischung von PEG 0,2 mg biotinylierte PEG-NHS-Ester (5.000 Da) und 8 13 mg NHS-Ester von mPEG (5.000 Da) in einem 1,5-ml-Röhrchen. Bei der Herstellung einer Anzahl N von Folien herzustellen N-fache Menge der PEG-Mischung in einem einzigen Rohr. Add 64 ul (oder N mal 64 &mgr; l für eine Anzahl N von Folien) des frisch hergestellten Puffer (Schritt 4.2). Pipettieren Sie es auf und ab, um sie vollständig zu lösen. Zentrifugieren mit 16.100 × g für 1 min, um Luftblasen zu entfernen. Danach pipettieren. Andernfalls wird Luftblasen bilden, die mit PEGylation stören bei Schritt 4.4. PEGylation. Tropfen 70 ul der PEGylierung Mischung auf eine getrocknete Folie aus Quarz Schritt 4.1. Verwenden Sie 90 ul bei 24 x 50 mm 2 coverslip. Sanft statt eines getrockneten Deckglas aus Schritt 4.1 über die Lösung. Um eine einheitliche und hohe Qualität der PEGylation haben, kümmern sich nicht um Luftblasen einzuführen. Aufgrund der Oberflächenspannung, die meisten der Luftbläschen spontan verlassen das Reaktionsvolumen innerhalb von fünf Minuten aufgrund der Oberflächenspannung. Die Folien Inkubation in einem dunklen und feuchten Umgebung. Die Halbwertszeit von NHS-Ester PEG, die wir verwenden bei pH 8 ist etwa eine Stunde. Zumindest inkubieren für 2 Stunden. Inkubation über Nacht führt zu höherer Qualität der PEGylierung (Daten nicht gezeigt). 5. Langzeitlagerung Speichern der PEGyliertem Rutschen und Deckgläser in N 2 bei -20 º C. Trocknen Rutschen und Deckgläser. Die Rutsche und das Deckglas vorsichtig zerlegen, indem das Deckglas zu einer Seite, spülen sie mit MilliQ H 2 O, und trocknen Sie sie mit N 2. Speichern von Dias und Deckgläser. For den sofortigen Einsatz, folgen Sie den Vorgang für die zweite Runde der PEGylation (Schritt 6). Um für einen längeren Zeitraum zu speichern, befolgen Sie die nächsten Schritte. Legen ein Paar von dem Schieber und dem Deckglas in einem 50 ml-Röhrchen, so dass die PEGylierte Flächen abgewandten zueinander. Teilweise schließen die Röhre, Vakuum der Röhre, und füllen Sie es mit N 2. Diese Schritte helfen Erhaltung der PEGylierten Fläche für einen langen Zeitraum. Schrauben Sie den Schlauch fest und bewahren Sie sie bei -20 ° C Die Qualität der Folien bleibt gut für bis zu 3 Monate (Abbildung 3, rechts). 6. Oberflächenpassivierung Verwendung von Polymer (der zweiten Runde) Weitere Runde der PEGylation die PEG-Schicht dichter zu machen und auch, um alle verbleibenden Aminogruppen auf der Oberfläche zu stillen. Der Einsatz von Kurz NHS-Ester PEG-Moleküle (333 Da) wirksam bei der Durchdringung in eine bestehende PEG-Schicht sein. Es ist recfohlen, diese zweite Runde der PEGylation rechts, bevor Sie eine Diashow zu tun. Vorbereiten Reaktionspuffer. Vorbereitung der frischen 0,1 M Natriumbicarbonat-Puffer (pH 8,5). Die gefrorene Lösung aus Schritt 4.2 können ebenfalls verwendet werden. Vorbereiten PEGylation Lösung. Auflösen 7 ul 250 mM MS4-PEG in 63 ul des Natriumbicarbonat-Puffer. PEGylation. Folgen Sie dem gleichen Verfahren wie in Schritt 4.4. Inkubation für 30 Minuten bis zu über Nacht. Trocknen Rutschen und Deckgläser. Demontieren Sie das Paar der Folie und das Deckglas, spülen sie mit MilliQ H 2 O, trocknen Sie sie mit N 2, und bewahren Sie sie an einem sauberen Pipette-Box. Gehen Sie zur Montage einer mikrofluidischen Kammer in Schritt 7. 7. Montage eines Mikrofluidik-Kammer Montage einer mikrofluidischen Kammer mit einem Paar aus einer PEG Quarz-Objektträger und Deckglas auflegen. Doppelseitiges Klebeband wird als Abstandshalter verwendet. Die Kammer ist mit Epoxy Klebstoff abgedichtet und soLösungen werden durch die Löcher in dem Quarz-Objektträger eingebracht. Legen Sie eine Quarz-Objektträger auf einer ebenen Fläche mit pegylierten Seite nach oben. Einen Kanal (Breite 5 bis 7 mm) schräg auf die Oberfläche PEGylierten indem doppelseitige Klebebänder über den Objektträger. Stellen Sie sicher, dass die Löcher in der Mitte des Kanals positioniert ist. Achten Sie darauf, das pegylierte Oberfläche während des Prozesses der Herstellung eine Kammer zu verwöhnen. Es ist möglich, eine Multi-Channel-Rutsche und das Festhalten, indem die doppelseitigen Klebebänder unterschiedlich (siehe Abbildung 2) zu machen. Sanft statt eine PEG Deckglas auf, um die Kammer zu vervollständigen. Das mit PEG Seite sollte nach unten. Verschließen Sie die Kammer, indem Sie die Deckglas über den Bereich, in dem doppelseitigen Klebebändern platziert werden. Tun Sie es sanft, aber gründlich, so dass die Kammer wird wasserdicht versiegelt. Schließen die Kanten der Kammer mit Epoxy Klebstoff. Immobilisieren Streptavidin oder Neutravidin auf diebiotinylierten PEG-Schicht durch Zugabe von 50 ul 0,1 mg / ml Streptavidin oder Neutravidin Lösung in T50 (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 50 mM NaCl-Puffer) unter Verwendung einer Pipette p200. Nach 1 min Inkubation bündig mit 100 ul Puffer T50. In biotinylierten biologischen Molekülen für Einzelmolekül-Imaging. 8. Schieben Recycling Recycling Quarz Rutschen. Gebrauchte Folien werden durch Abnehmen der Deckgläser und die doppelseitige Klebebänder recycelt. Nach Gebrauch speichern die Kammern in Leitungswasser. Langzeit-Inkubation in Wasser erleichtert die Demontage der Kammern. Kochen Sie die Kammern in Leitungswasser mit Hilfe einer Mikrowelle. Verwenden Sie ein Pyrex-Becher. Kochen Sie für 10 Minuten oder länger. Nehmen Sie die Deckgläser und die doppelseitige Klebebänder mit einer Rasierklinge. Sie drücken eine Quarz-Objektträger nicht senkrecht zu ihrer Ebene. Andernfalls bricht es. Halten Sie die Rasierklinge aus dem Kanal. Otchts, sonst führt sie Kratzer auf dem Kanal. Spülen Sie die Folien mit einem Haushaltsreinigungsmittel durch Reiben mit den Fingern. Objektträger in einem Glas Küvette. Typischerweise 5 bis 15 gleitet in einem einzigen Gefäß gegeben werden. In 10% Haushaltsreiniger und beschallen die Objektträger für 20 Minuten oder länger. Mit einer großen Menge Wasser abspülen Registerkarte Folien. Gehen Sie zu Schritt 1.2.