表面钝化单分子蛋白质研究

1，玻片制备及清洗 一种微流体腔是由一个石英载玻片和盖玻片的。在棱镜型全内反射荧光（TIRF）显微镜，在石英片的表面进行成像。因此，要彻底清洗采用H 2 O，丙酮，氢氧化钾，以及食人鱼解决方案的石英片是很重要的。 th是多步清洗消除了在其上用单分子荧光测量干涉表面荧光有机分子。此外，食人鱼蚀刻产生羟基，使石英表面的亲水性。游离羟基基团是在步骤3中的氨基硅烷化反应是必不可少的。 钻井石英幻灯片。钻一对孔与3/4 mm金刚石钻头（ 图2a）一个石英片。如果有多个信道是理想的，更钻年利率孔IRS（ 图2b）。这些孔用来注入的解决方案为在第7步微流体室。 保持钻头在湿H 2 O的钻井过程中。 H 2 O的执行作为润滑剂，从而增加了钻头的使用寿命。 偶尔擦钻头的尖有助于钻孔。 在聚乙二醇化过程后钻孔，标志着滑动，便于识别的一面。这些标记可以作为参考，以避免以后会混淆。对于标记，金刚石钻头都可以使用。不要使用任何笔，因为油墨可能会在表面上。 用H 2 O清洗将玻片在玻璃染色缸。通常为5〜15的幻灯片可以被放置在一个单一的罐子。冲洗的幻灯片用MilliQ H 2 O重复3次，超声处理的玻片用MilliQ H 2 O的5分钟，去除污垢。处理水并再次冲洗载玻片3次的MilliQ H 2 O 请注意，130 W是用于该协议的超声功率。较高的超声功率可能会降低石英玻片的寿命。 清洁用丙酮。取代的MilliQ H 2 O和丙酮。超声处理的载玻片，用丙酮进行20分钟或更长的时间。 用H 2 O漂洗丢弃丙酮和冲洗载玻片用MilliQ H 2 O为了消除任何残留的丙酮重复3次。 清洗用KOH。用1 M KOH代替水和超声处理的玻片20分钟或更长的时间。过度蚀刻（ 如过夜KOH处理）会提高表面质量，但会引入划痕，这可能与荧光成像的干扰。 用H 2 O漂洗冲洗用MilliQ H 2 O的3倍，幻灯片，除去氢氧化钾的痕迹。 食人鱼腐蚀。 转让幻灯片到幻灯片杜兰持有人或一个特制的铁弗龙座和特等王牌它们在烧杯中（1L），其位于化学罩。 450毫升H 2 SO 4填充烧杯中。 加入150毫升H 2 O 2为3:1比H 2之间SO 4和H 2 O 2。一旦溶液开始沸腾自发地，温度升高超过90℃。确保该H 2 O 2溶液在室温下开始反应之前。否则，该沸腾的溶液的温度可能低于90℃。 搅拌适当的混合溶液，并让烧杯静置20分钟。 就拿滑出食人鱼解决方案的幻灯片夹在一起，并把它们含有的MilliQ H 2 O滑动架与此同时，废弃的食人鱼溶液放入指定废物瓶一旦达到室温。 漂洗玻片3次用MilliQ H 2 O。要特别注意采取进一步输注液PS避免幻灯片的任何可能的污染。继续执行步骤3。这是应立即着手进行下面的步骤。 *注意：食人鱼的解决方案是非常被动的。在处理这个解决方案要格外小心，应采取。此外，当错误地用有机溶剂如丙酮混合，它可能会引起爆炸。 2，清洗盖玻片 一种微流体腔是由石英片和面黏贴唇。当棱镜类型的TIRF显微镜的情况下，盖玻片的表面上不成像。因此，它是足够的清洗盖玻片仅与H 2 O和KOH。万一盖玻片需要进行成像（例如，通过客观型TIRF显微镜），推荐的治疗盖玻片用食人鱼溶液（步骤1.7）。请注意，如果盖玻片表面的PEG化是一种高品质不是，它可能作为蛋白质水槽的ð引起的变化的蛋白质浓度。 用H 2 O漂洗地方盖玻片（24×30，24×40或24×50毫米2）在一个玻璃染色缸。通常为5〜15的盖玻片可以被放置在一个单一的罐子。冲洗盖玻片3次用的MilliQ H 2 O。 清洗用KOH。用1M KOH代替水和超声处理的盖玻片20分钟或更长的时间。 用H 2 O漂洗冲洗盖玻片3次，用MilliQ H 2 O的去除KOH的痕迹。继续执行步骤3。 3，氨基硅烷化的载玻片和盖玻片的 通过氨基硅烷化的化学官能化的石英载玻片，并与胺基团的盖玻片的表面上。使用甲醇作为溶剂和乙酸作为催化剂的氨基硅烷化反应。 漂洗用甲醇。取代的MilliQ H 2 O的在染色菜肴（从sTEPS 1和2）用甲醇。请甲醇的幻灯片和盖玻片，直到步骤3.3。不存储在甲醇中的幻灯片和盖玻片的时间过长的时期（ 例如数小时），因为在甲醇中的杂质会吸附到表面上。 准备氨基硅烷化的解决方案。 冲洗一个耐热瓶数次用甲醇。超声处理的烧瓶中，用甲醇为5分钟或更长的时间。这是应具有保持清洁的专用瓶。 倒入100ml的甲醇加入到烧瓶中。 加入5毫升乙酸。 ，加入3 mL APTES（3 – 氨丙基三甲氧基硅烷），并通过摇动它轻轻混匀。 氨基硅烷化。代替甲醇中包含的幻灯片和盖玻片与aminosilanization反应混合物的染色皿。 孵育20-30分钟。在培养过程中，超声处理一次，持续​​1分钟。 漂洗用甲醇。更换一个用甲醇minosilanization反应。弃去甲醇，加入新鲜的甲醇溶液。重复此步骤三次。 4，表面钝化用聚合物（第一轮） 通过偶联NHS-酯的聚乙二醇（PEG）钝化的石英载玻片和盖玻片胺涂覆的表面。此反应是用在pH 8.5的PEG溶液中的饱和浓度过夜。 干燥载玻片和盖玻片。干燥用N 2气的幻灯片和盖玻片并将其放置在清洁吸液管箱以这样的方式，该侧具有被聚乙二醇化的朝上。移液管箱部分地填充用MilliQ H 2 O的这种潮湿的环境中防止聚乙二醇化解决方案，从过夜培养过程中干燥。 准备反应缓冲液。通过在10ml的溶解84毫克碳酸氢钠制备的新鲜的碳酸氢钠缓冲液（pH 8.5）的0.1M的MilliQ H 2 O。没有必要调节pH值的。此溶液可以冷冻储存为下一次使用（ 如步骤6.1）。 准备聚乙二醇化的解决方案。 制备0.2毫克在1.5毫升管的生物素化的NHS-酯PEG（5000道尔顿）13和8毫克的NHS-酯的mPEG（5000道尔顿）的聚乙二醇混合物。当使用幻灯片的N个 ，在单管中制备的N倍大的PEG混合物的量。 加入64微升（或N次64微升为幻灯片的N个 ）新鲜制备的缓冲（步骤4.2）中。移液器向上和向下，以完全溶解它们。 以16100×g离心1分钟，离心以除去气泡。不要吸取之后。否则，气泡将形成与PEG化在步骤4.4干扰。 聚乙二醇化。 从步骤4.1滴70微升的聚乙二醇化混合物至干燥石英片。用90微升的情况下为24×50毫米2 COVerslip。 轻轻地放在一个干燥的盖玻片从4.1步在解决方案。 有聚乙二醇化的统一和高品质，注意不要引入气泡。由于表面张力，大部分的气泡可能自发地离开5分钟由于表面张力中的反应体积。 孵育的幻灯片在一个阴暗潮湿的环境。半衰期的NHS-酯的PEG，我们在pH 8使用的是大约一小时。至少，它们孵育2小时。过夜孵育导致PEG化（数据未示出）的质量更高。 5，长期贮存 存储PEG化幻灯片和的N 2盖玻片在-20ºC。 干燥载玻片和盖玻片。小心拆开载玻片和盖玻片滑动盖玻片一侧，用MilliQ H 2 O的冲洗一下，并用N 2干燥。 存储载玻片和盖玻片。佛ř立即使用，遵循第二轮聚乙二醇化（步骤6）的过程。为了保存的时间较长，请遵循下面的步骤。 放置一对在50ml管中，使得所述聚乙二醇化的表面面向远离彼此的载玻片和盖玻片的。 局部关闭管，吸尘管，然后用氮气填充。这些步骤有助于维护PEG化表面的很长一段时间。拧紧管，并将其存储在-20°C。幻灯片的质素维持良好长达3个月（ 图3a，右 ）。 6，表面钝化用聚合物（第二轮） 额外轮PEG化的，使PEG层更致密，并骤冷的表面上的任何剩余胺基团。使用短的NHS-酯的PEG分子（333道尔顿）的可有效地穿透到现有的PEG层。这是拍摄勾选的使用幻灯片之前对做这第二轮的聚乙二醇化。 准备反应缓冲液。制备新鲜的碳酸氢钠缓冲液（pH 8.5），0.1M的。从步骤4.2将冷冻的溶液也可使用。 准备聚乙二醇化的解决方案。溶解7微升250mM的MS4-PEG在63微升的碳酸氢钠缓冲液中。 聚乙二醇化。按照同样的步骤，如步骤4.4。温育30分钟到过夜。 干燥载玻片和盖玻片。拆机对幻灯片和盖玻片，冲净，用MilliQ H 2 O，与N 2干他们，并让他们在一个干净的吸管盒。进行组装微流体室中第7步。 7，装配微流控室 组装微流体室中，利用一对PEG化的石英载玻片和盖玻片。双面胶带被用作间隔物。该腔室是密封的环氧树脂胶和，所以lutions是通过在石英片上的孔引入。 放置在一个平面上的石英片与聚乙二醇化的一面朝上。 做一个通道（宽度为5〜7mm）对角线上的聚乙二醇化表面通过将双面胶带粘在幻灯片。确保该孔被设置在通道的中心。小心不要让一个室的过程中破坏聚乙二醇化表面。这是可能的放置和坚持不同的双面粘胶带（ 见图2），使多通道投影片。 轻轻地放置在顶部的聚乙二醇化盖玻片完成室。 PEG化的一面应朝下。 通过按压盖玻片其中双面胶带放置在密封区域的室中。做到这一点，但轻轻地彻底地使腔体变得水密封。 收用环氧胶腔的边缘。 链霉亲和固定化或中性亲上生物素化的PEG层用P200移液管加入50μl的链霉亲和或中性亲和素在T50溶液（10mM的Tris-HCl [pH为8.0]，50 mM氯化钠缓冲液）0.1毫克/毫升。后1分钟温育，用100μl的缓冲T50平齐。 加入生物素标记的生物分子为您的单分子成像。 8，滑动回收 回收石英幻灯片。用过的载玻片回收由脱盖玻片和双面粘合胶带。 使用后，存放在自来水室。在水中长期孵化简化的室拆卸。 采用微波煮沸自来水中的腔。使用耐热玻璃烧杯中。煮沸10分钟或更长的时间。 取下用刀片盖玻片和双面粘性胶带。不要按一个石英片垂直于平面。否则，它打破。保持刀片远离通道。 OTherwise，它引入了通道上的划痕。 使用家用洗涤剂用手指揉搓它们冲洗的幻灯片。 将玻片在玻璃染色缸。通常为5〜15的幻灯片可以被放置在一个单一的罐子。加入10％的家用清洁剂和超声处理的玻片20分钟或更长的时间。冲洗的幻灯片与大量标签的水。 转到步骤1.2。