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Neurosciences

장기 상승 작용으로 매우 안정하고 재현성 기록을위한 향상된 준비 및 해마 마우스 조각의 보존

Published: June 26, 2013
doi:
10.3791/50483
,
1Department of Neurosciences, Research Institute for Biosciences,University of Mons

Summary

이 논문은 준비하고 유지하는 완벽한 방법을 제공합니다<em> 체외에서</em성인 생쥐> 급성 해마 조각. 이 프로토콜은 95 %의 성공률로 8 시간 이상 아주 안정되어 오래 지속되는 장기 potentiation (LTP)의 녹음을 할 수 있습니다.

Abstract

장기 상승 작용 (LTP)는 시냅스 강도의 증가에 의해 특징 시냅스 가소성의 한 종류이며 메모리 인코딩에 관련된 것으로 믿었다. LTP는 광범위하게 연구되어왔다 급성 해마 슬라이스의 CA1 지역에 이끌려. 그러나이 현상의 유지 보수 단계의 기초가되는 분자 메커니즘은 여전히​​ 제대로 이해하고 있습니다. 이 서로 다른 실험실에서 사용하는 다양한 실험 조건에 부분적으로 인해 수 있습니다. 사실, LTP의 유지 보수 단계는 산소, 온도 및 습도 등 외부 변수에 크게 의존한다. 또한 절개 후 슬라이스 평면과 조각 생존의 방향이 같은 내부 파라미터에 따라 달라집니다.

이러한 모든 매개 변수의 최적화는 매우 재현성이 매우 안정적인 장기 상승 작용을 유도 할 수 있습니다. 이 방법은 더 안정적인 증가에 관련된 분자 메커니즘을 탐구 할 수있는 가능성을 제공합니다해마 슬라이스 시냅스 강도를합니다. 또한 신경 생리 학적 현상의 체외 조사에서의 실험 조건의 중요성을 강조한다.

Introduction

요즘 복잡한 메모리를 저장하고 신경 회로 수준에서 호출하는 방법의 제한으로 이해가있다. 그러나 메모리 스토리지의 통합 가설이 가능하고 광범위하게 허용됩니다 : 메모리는 중추 신경계의 뉴런 사이의 시냅스 연결의 강도의 변화로 저장됩니다. 자신에 시냅스 가소성에 대한 연구는 크게 두 가지 획기적인 발견의 혜택을 받았다. (1)에서 그대로 마취 토끼를 사용하여 정액 실험, 행복과 로모 1, 짧은 높은 주파수 (1 초, 100 Hz에서) 해마의 perforant 경로에 자극의 전달이 오랫동안 (몇을 일으키는 원인 발견 시간) 관련 시냅스 연결의 증가. 이 매혹적인 현상 1975 2 더글러스 고다드에 의해 "장기 상승 작용"또는 LTP를 불렀습니다. (2) 나중에, 그것은 유사한 현상 (0.4 mm) 뇌 조각에서 트리거 될 수있는 것으로 나타났습니다 인위적으로 체외에서 살아 유지 </eM>. 가장 널리 연구 LTP는 소위 CA1 영역의 피라미드 신경 세포에서 유발의 결과 필드 흥분성 시냅스 전위를 기록하는 동안 축삭 (소위 샤퍼의 담보)의 번들로 하나 또는 여러 tetani에 전달하여 체외에서 관찰되었다. LTP 유도의 메커니즘은 크게 공개되었다. AMPA 수용체의 인산화 (효율성 증가)과 시냅스 막 3 여분의 AMPA 수용체의 결합 : 기본적으로, NMDA 수용체를 통한 칼슘 2 + 유입은 두 가지 결과를 초래 효소를 활성화합니다. 이 실험적으로 훨씬 더 어려운 30 ~ 60 분보다 몇 시간 동안 건강한 슬라이스를 유지하는 것입니다 특히 때문에 대조적으로, LTP의 유지 보수 단계의 메커니즘은 대부분 알 수 있습니다.

연구의 많은 LTP 메커니즘과 흥미로운 이론의 이해에 전념 한이 년 4-11에 정교하고있다. 그러나 유엔틸 지금, 시냅스 강도 안정적인 증가를 기본 정확한 분자 메커니즘이 밝혀되지 않았습니다. 이 준비를 위해 서로 다른 기술을 사용하여 서로 다른 실험실에서 이전 결과를 재현하는 어려움과 해마 슬라이스의 유지에 부분적으로 인해 수 있습니다. 자신의 방법론 논문에서는 Sajikumar 등. 12 쥐의 해마 슬라이스와 안정 LTP의 기록의 준비를 위해 실험 조건의 중요성을 강조했다. 이 비디오에서 우리는 쥐 해마 슬라이스에 매우 안정적인 LTP를 기록 할 수 년 동안 우리 실험실에서 개발 된 모든 최적화 단계를 제시한다.

이 최적화는 쥐 13 쥐 11 LTP 메커니즘을 연구 다른 실험실에서 개발하고 성공적으로 사용되는 프로토콜에서 변경되었습니다. 그것은 경험이 풍부한 연구자 유도하고 성공의 높은 속도를 가진 성인 마우스에서 매우 오래 지속 LTP를 기록 할 수 있습니다. P유도 된 LTP의 hysiological 기준은주의 깊게 검사하고 14 증명되었다. 이 방법론의 논문에서, 우리는 해부 절차 깊이 슬라이스 흥분을 수정할 수 있지만 온도 나 산소와 같은 실험 조건의 수정, LTP 유지에 지대한 영향을 미칠 수 있음을 보여줍니다. 또한 이러한 모든 매개 변수의 정밀 제어가 초보 학생들을위한 몇 개월의 교육을 필요로하는 강조해야합니다.

Protocol

모든 동물의 절차는 연구에 동물의 관리 및 사용에 대한 보건 규정의 국립 연구소에 따라 그리고 지역 윤리위원회의 계약을 수행 하였다. 1. 인공 세리 – 척수의 준비 동일한 매체가, 해부 잘라 휴식 기간 전기 생리학 녹음하는 동안 조각 (1 ML / 분) 붓는다하는 데 사용됩니다. 이 매체는 124 mM의 NaCl을 4.4 mM의 KCl을 26 mM의 NaHCO3를, 1 ㎜의 NaH 2 P…

Representative Results

이 방법은 성인 C57BL/6J 마우스 (잰 비어 SAS, 프랑스)의 14에서 급성 해마 슬라이스에 유도 오래 지속되는 장기 상승 작용의 특성을 분석하는 데 사용되었습니다. 놀랍게도, 실험 조건의 개선은 LTP를 바라 보는 새로운 방식을 주도하고있다. 우리는 시냅스 강도의 지속적인 증가는 새로운 단백질의 합성을 요구하지 않은 것으로 나타났다. 여기, 우리는 LTP 유도가 슬라이?…

Discussion

우리는 우리의 실험실에서 개발 LTP 녹음 11,17에 큰 전문 지식을 가진 다른 실험실에서 사용되는 방법의 조합에 따른 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 성인 쥐 해마에 적응하고 모든 연령 및 배경 유전자형의 동물에 사용할 수 있습니다. 또한 알츠하이머 병 18,19 같은 neurodegenerative 질병을 개발하는 형질 전환 생쥐에서 LTP의 분석을 할 수 있습니다.

쥐?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 기술 지원 버나드 Foucart 감사합니다. 이 작품은 과학 연구를위한 벨기에 기금 (FRS-FNRS)에 의해 의료 연구를위한 엘리자베스 여왕 기금에 의해 지원되었다. 아녜스 빌러는 과학 연구를위한 벨기에 기금의 연구원입니다.

Materials

      Reagent/Material
NaCl Sigma – Aldrich S7653  
NaHCO3 Sigma – Aldrich S8875  
KCl Sigma – Aldrich P9333  
D-glucose Sigma – Aldrich G7528  
NaH2PO4 Sigma – Aldrich S9638  
MgSO4 1M Sigma – Aldrich 63126  
CaCl2 Sigma – Aldrich C4901  
Carbogen Air Liquide (Belgium)    
Capillaries WPI, Inc. (UK) TW150-4  
Stimulating Electrodes FHC (USA) CE2B30  
Surgical tools FST (Germany)    
Filter paper 84 g/m2 Sartorius FT-3-105-110  
Mesh Lycra 15 den  
Glue UHU plus endfest300  
      Instrument
Amplifier WPI, Inc. (UK) ISO-80  
Interface recording chamber FST (Germany)    
Peristaltic pumps Gilson (USA) Minipuls 3  
Temperature controller University of Edinburgh www.etcsystem.com  
Tissue Chopper Mcllwain    
Stimulators Grass (USA) S88X + SIU-V  
Program analysis WinLTP www.winltp.com  
Micromanipulators Narishige MM-3 and MMO-220A  
Surgical microscope Leica Microsystem    
A/D converter National Instruments NIPCI-6229 M-series  

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References

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Hippocampal SlicesLong-term PotentiationLTPSynaptic PlasticityMemory EncodingCA1 RegionExperimental ConditionsOxygenationTemperatureHumiditySlice OrientationSlice ViabilityReproducibilityStable LTPMolecular MechanismsSynaptic Strength

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Citer Cet Article
Villers, A., Ris, L. Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation. J. Vis. Exp. (76), e50483, doi:10.3791/50483 (2013).
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