Uzun vadeli potansiyelize bir çok Kararlı ve tekrarlanabilir Kayıt için geliştirilmiş Hazırlık ve Hipokampal Fare Dilimleri korunması
Summary
Bu makale hazırlamak ve korumak için tam bir metodoloji sunar<em> In vitro</emYetişkin farelerin> akut hipokampal dilim. Bu protokol% 95 başarı oranı ile fazla 8 saat boyunca çok sağlam uzun ömürlü uzun vadeli potansiyasyonu (LTP) ve kayıt sağlar.
Abstract
Uzun vadeli potensiyalizasyon (LTP) sinaptik gücü bir artış ile karakterize sinaptik plastisite türüdür ve bellek kodlama dahil olmak inanıyordu. LTP yoğun çalışılmıştır akut hipokampal dilim CA1 bölgesinde ortaya çıkardı. Ancak bu olayın bakım aşamasında altında yatan moleküler mekanizmalar hala tam olarak anlaşılamamıştır. Bu farklı laboratuarlar tarafından kullanılan çeşitli deneysel koşullar, kısmen bağlı olabilir. Gerçekten de, LTP bakım aşamasında oksijen, sıcaklık ve nem gibi dış parametrelere sıkı bir şekilde bağlıdır. Ayrıca diseksiyonu sonra dilimleme uçak ve dilim canlılığı yönelim gibi iç parametreleri bağlıdır.
Tüm bu parametrelerin optimizasyonu çok tekrarlanabilir ve çok istikrarlı uzun vadeli potensiyasyonun indüksiyon sağlar. Bu metodoloji daha da istikrarlı bir artış yer alan moleküler mekanizmaları keşfetmek için imkan sunuyorhipokampal dilim sinaptik gücü. Ayrıca nörofizyolojik olayların in vitro soruşturma deneysel koşullarının önemini vurgulamaktadır.
Introduction
Günümüzde, karmaşık anıları saklanır ve nöronal devre düzeyinde hatırlattı nasıl sınırlı anlayış vardır. Ancak, bellek depolama birleştirici bir hipotez mevcut ve genel olarak kabul edilir: hafızası merkezi sinir sistemindeki nöronlar arasındaki sinaptik bağlantıların gücü değişiklikleri olarak depolanır. Kendi başına, sinaptik plastisite araştırma büyük ölçüde iki atılım keşifler yararlanmıştır. (1) olarak sağlam anestezi tavşan kullanarak yeni ufuklar açan bir deney, Bliss ve Lomo 1,, kısa bir yüksek frekanslı (1 sn, 100 Hz) hipokampus olan delici yoluna stimülasyon teslim uzun süreli (birkaç neden olduğu bulundu saat) ilgili sinaptik bağlantıları artış. Bu büyüleyici fenomen 1.975 2 Douglas ve Goddard tarafından "Uzun Vadeli potansiyelize" veya LTP denirdi. (2) Daha sonra, benzer bir olay (0.4 mm) beyin dilimleri içinde devreye girebilir bulunmuştur yapay in vitro canlı tutulur </em>. En yaygın olarak incelenmiştir LTP sözde CA1 bölgesinde piramidal nöronlarda uyarılmış çıkan alan uyarıcı sinaptik potansiyel kayıt sırasında aksonlar (sözde Schaffer kollateral) bir paket için bir veya birkaç tetani sunarak, in vitro tespit edildi. LTP indüksiyon mekanizmaları büyük ölçüde ortaya konmuştur. AMPA alıcılarının fosforilasyonuyla (verimlilik artar) ve post-sinaptik zar 3 ilave AMPA alıcılarının bir birleşme: Temel olarak, NMDA reseptörleri ile Ca2 + akışı, iki sonuçları olan enzimleri aktive. Deneysel olarak çok daha zor 30-60 dakika boyunca daha uzun saatler boyunca sağlıklı bir dilim sağlamaktır, özellikle, çünkü aksine, LTP bakım fazı mekanizmaları tam olarak bilinmemektedir.
Birçok çalışma, LTP mekanizmaları ve ilginç teorileri anlayışı ithaf edilmiş yıllar 4-11 üzerinde ayrıntılı edilmiştir. Ama until şimdi, sinaptik gücü istikrarlı bir artış altında yatan kesin moleküler mekanizmaları ortaya konamamıştır. Bu hazırlanması için farklı teknikler kullanarak farklı laboratuvarlarda önceki sonuçları yeniden zorluk ve hipokampal dilim bakım kısmen olabilir. Onların metodoloji yazıda, Sajikumar ve ark. 12 sıçan hipokampal dilimleri ve istikrarlı LTP kayıt hazırlanması için deneysel koşullar önemini vurguladı. Bu videoda fare hipokampal dilim çok istikrarlı LTP kayıt edebilmek için yıllar boyunca laboratuarımızda geliştirilen tüm optimizasyon adımları sunuyoruz.
Bu optimizasyon farenin 13 ve 11 sıçan LTP mekanizmaları incelemek diğer laboratuarlar tarafından geliştirilmiştir ve başarılı bir şekilde kullanılan protokoller yapılmıştır. Bu deneyimli araştırmacılar neden ve başarı oranı yüksek olan yetişkin farelerde çok uzun ömürlü LTP kaydetmenize olanak verir. Pbağlı LTP hysiological olarak dikkatli bir şekilde kontrol ve 14 gösterilmiştir. Bu metodoloji yazıda, diseksiyon işlemi derin dilimleri heyecanlanma değiştirebilirsiniz ise sıcaklık veya oksijen gibi deneysel koşullardan herhangi bir değişiklik, LTP bakım üzerinde derin bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Ayrıca tüm bu parametrelerin hassas kontrol acemi öğrenciler için birkaç aylık bir eğitim gerektirdiğini vurgulamak gerekir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz laboratuvarda geliştirilen ve LTP kayıtları 11,17 büyük bir uzmanlığa sahip diğer laboratuvarlar tarafından kullanılan yöntemlerin kombinasyonu kaynaklanan bir protokol geliştirdik. Bu protokol, yetişkin fare hipokampus adapte edilir ve her yaşta ve arka plan genotip hayvanlarda kullanılabilir. Ayrıca, Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların 18,19 gelişmekte olan transgenik farenin LTP analizine izin verir.
Sıçan hipokampal di…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Teknik yardım için Bernard Foucart teşekkür ederim. Bu çalışma Bilimsel Araştırma Belçika Fonu (FRS-FNRS) tarafından ve Tıbbi Araştırma Kraliçe Elisabeth Fonu tarafından desteklenmiştir. Agnès Villers Bilimsel Araştırma için Belçika Fonu Araştırma üyesidir.
Materials
| Reagent/Material | |||
| NaCl | Sigma – Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma – Aldrich | S8875 | |
| KCl | Sigma – Aldrich | P9333 | |
| D-glucose | Sigma – Aldrich | G7528 | |
| NaH2PO4 | Sigma – Aldrich | S9638 | |
| MgSO4 1M | Sigma – Aldrich | 63126 | |
| CaCl2 | Sigma – Aldrich | C4901 | |
| Carbogen | Air Liquide (Belgium) | ||
| Capillaries | WPI, Inc. (UK) | TW150-4 | |
| Stimulating Electrodes | FHC (USA) | CE2B30 | |
| Surgical tools | FST (Germany) | ||
| Filter paper 84 g/m2 | Sartorius | FT-3-105-110 | |
| Mesh | Lycra | 15 den | |
| Glue | UHU | plus endfest300 | |
| Instrument | |||
| Amplifier | WPI, Inc. (UK) | ISO-80 | |
| Interface recording chamber | FST (Germany) | ||
| Peristaltic pumps | Gilson (USA) | Minipuls 3 | |
| Temperature controller | University of Edinburgh | www.etcsystem.com | |
| Tissue Chopper | Mcllwain | ||
| Stimulators | Grass (USA) | S88X + SIU-V | |
| Program analysis | WinLTP | www.winltp.com | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 and MMO-220A | |
| Surgical microscope | Leica Microsystem | ||
| A/D converter | National Instruments | NIPCI-6229 M-series |
References
- Bliss, T. V., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232 (2), 331-356 (1973).
- Douglas, R. M., Goddard, G. V. Long-term potentiation of the perforant path-granule cell synapse in the rat hippocampus. Brain Res. 86, 205-215 (1975).
- Squire, L., Kandel, E. . Memory: From mind to molecules. , (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265 (5175), 1104-1107 (1994).
- Frey, U., Morris, R. G. Synaptic tagging and long-term potentiation. Nature. 385 (6616), 533-536 (1038).
- Bortolotto, Z. A., Collingridge, G. L. A role for protein kinase C in a form of metaplasticity that regulates the induction of long-term potentiation at CA1 synapses of the adult rat hippocampus. Eur. J. Neurosci. 12 (11), 4055-4062 (2000).
- Migues, P. V., Hardt, O., et al. PKMzeta maintains memories by regulating GluR2-dependent AMPA receptor trafficking. Nat. Neurosci. 13 (5), 630-634 (2010).
- Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. -. C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54 (3), 447-460 (2007).
- Vickers, C. A., Dickson, K. S., Wyllie, D. J. A. Induction and maintenance of late-phase long-term potentiation in isolated dendrites of rat hippocampal CA1 pyramidal neurones. J. Physiol. 568 (3), 803-813 (2005).
- Fonseca, R. Activity-dependent actin dynamics are required for the maintenance of long-term plasticity and for synaptic capture. Eur. J. Neurosci. 35 (2), 195-206 (2012).
- Redondo, R. L., Okuno, H., Spooner, P. A., Frenguelli, B. G., Bito, H., Morris, R. G. M. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J. Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 15 (5), 607-613 (2005).
- Connor, S. A., Wang, Y. T., Nguyen, P. V. Activation of beta-adrenergic receptors facilitates heterosynaptic translation-dependent long-term potentiation. J. Physiol. 589 (17), 4321-4340 (2011).
- Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Long-lasting LTP requires neither repeated trains for its induction nor protein synthesis for its development. PLoS One. 7 (7), e40823 (2012).
- Capron, B., Sindic, C., Godaux, E., Ris, L. The characteristics of LTP induced in hippocampal slices are dependent on slice-recovery conditions. Learn. Mem. 13 (3), 271-277 (2006).
- Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Late phase of L-LTP elicited in isolated CA1 dendrites cannot be transferred by synaptic capture. Neuroreport. 21, 210-215 (2010).
- Nguyen, P. V., Kandel, E. R. Brief theta-burst stimulation induces a transcription-dependent late phase of LTP requiring cAMP in area CA1 of the mouse hippocampus. Learn. Mem. 4 (2), 230-243 (1997).
- Dewachter, I., Ris, L., et al. Modulation of synaptic plasticity and Tau phosphorylation by wild-type and mutant presenilin1. Neurobiol. Aging. 29 (5), 639-652 (2008).
- Dewachter, I., Filipkowski, R. K., et al. Deregulation of NMDA-receptor function and down-stream signaling in APP[V717I] transgenic mice. Neurobiol. Aging. 30 (2), 241-256 (2009).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology. J. Vis. Exp. (49), e2330 (2011).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
- Alger, B. E., Dhanjal, S. S., Dingledine, R., Garthwaite, J., Henderson, G., King, G. L., Dingledine, R., et al. Appendix: Brain slice methods. Brain Slices. , 381-437 (1984).
- Watson, P. L., Weiner, J. L., Carlen, P. L. Effects of variations in hippocampal slice preparation protocol on the electrophysiological stability, epileptogenicity and graded hypoxia responses of CA1 neurons. Brain Res. 775, 134-143 (1997).
- Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. Anisomycin, an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro. Brain Res. 452 (1-2), 57-65 (1988).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Fonseca, R., Nägerl, U. V., Bonhoeffer, T. Neuronal activity determines the protein synthesis dependence of long-term potentiation. Nat. Neurosci. 9 (4), 478-480 (2006).
- Rudy, J. W. Is there a baby in the bathwater? Maybe: some methodological issues for the de novo protein synthesis hypothesis. Neurobiol. Learn. Mem. 89 (3), 219-224 (2008).
- Sharma, A. V., Nargang, F. E., Dickson, C. T. Neurosilence: Profound Suppression of Neural Activity following Intracerebral Administration of the Protein Synthesis Inhibitor Anisomycin. J. Neurosci. 32 (7), 2377-2387 (2012).
- Volianskis, A., Jensen, M. S. Transient and sustained types of long-term potentiation in the CA1 area of the rat hippocampus. J. Physiol. 550 (2), 459-492 (2003).
- Ris, L., Villers, A., Godaux, E. Synaptic capture-mediated long-lasting long-term potentiation is strongly dependent on mRNA translation. Neuroreport. 20 (17), 1572-1576 (2009).
- Abbas, A. -. K., Dozmorov, M., et al. Persistent LTP without triggered protein synthesis. Neurosci. Res. 63 (1), 59-65 (2009).
- Ho, O. H., Delgado, J. Y., O’Dell, T. J. Phosphorylation of proteins involved in activity-dependent forms of synaptic plasticity is altered in hippocampal slices maintained in vitro. J. Neurochem. 91, 1344-1357 (2004).
- Whittingham, T. S., Lust, W. D., Christakis, D. A., Passonneau, J. V. Metabolic stability of hippocampal slice preparations during prolonged incubation. J. Neurochem. 43, 689-696 (1984).
- Dunlop, D. S., van Elden, W., Lajtha, A. Optimal conditions for protein synthesis in incubated slices of rat brain. Brain Res. 99, 303-318 (1975).
- Taubenfeld, S. M., Stevens, K. A., Pollonini, G., Ruggiero, J., Alberini, C. M. Profound molecular changes following hippocampal slice preparation: loss of AMPA receptor subunits and uncoupled mRNA/protein expression. J. Neurochem. 81 (6), 1348-1360 (2002).
- Gruart, A., Munoz, M. D., Delgado-Garcia, J. M. Involvement of the CA3-CA1 synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice. J. Neurosci. 26 (4), 1077-1087 (2006).
- Whitlock, J. R., Heynen, A. J., Shuler, M. G., Bear, M. F. Learning induces long-term potentiation in the hippocampus. Science. 313, 1093-1097 (2006).
- Grant, S. G. N., Silva, A. J. Targeting learning. TINS. 17 (2), 71-75 (1994).
- Izquierdo, I., Medina, J. H., Vianna, M. R. M., Izquierdo, L. A., Barros, B. M. Separate mechanisms for short- and long-term memory. Behav. Brain Res. 103, 1-11 (1999).
- Morice, E., Andreae, L. C., Cooke, S. F., Vanes, L., Fisher, E. M. C., Tybulewicz, V. L. J., Bliss, T. V. P. Preservation of long-term memory and synaptic plasticity despite short-term impairments in the Tc1 mouse model of Down syndrome. Learn Mem. 15 (7), 492-500 (2008).
- Dunlop, D. S., van Elden, W., Plucinska, I., Lajtha, A. Brain Slice Protein Degradation and Development. J. Neurochem. 36, 258-265 (1981).
- Izquierdo, I. Long-term potentiation and the mechanisms of memory. Drug Dev. Res. 30, 1-17 (1993).
