تحسين إعداد والحفاظ على شرائح الحصين ماوس لتسجيل مستقرة جدا وقابلة للتكرار من التقوية بعيدة المدى
Summary
وتعرض هذه الورقة منهجية كاملة لإعداد والحفاظ على<em> في المختبر</em> شرائح الحصين الحادة من فئران بالغة. هذا البروتوكول يسمح للتسجيل من التقوية طويلة الأجل طويلة الأمد مستقرة جدا (الكمونية) لأكثر من 8 ساعات مع نسبة نجاح 95٪.
Abstract
التقوية الطويلة الأمد (الكمونية) هو نوع من اللدونة متشابك يتميز بزيادة في قوة متشابك ويعتقد أن تشارك في ترميز الذاكرة. أثارت الكمونية في المنطقة CA1 من شرائح الحصين الحادة وقد درس على نطاق واسع. ولكن الآليات الجزيئية الكامنة وراء مرحلة الصيانة لهذه الظاهرة لا تزال غير مفهومة تماما. هذا قد يكون عائدا جزئيا إلى مختلف الظروف التجريبية المستخدمة من قبل مختبرات مختلفة. والواقع أن مرحلة الصيانة من الكمونية وتعتمد بشدة على معايير خارجية مثل الأوكسجين ودرجة الحرارة والرطوبة. بل هو أيضا تعتمد على المعلمات الداخلية مثل التوجه للطائرة تشريح والجدوى شريحة بعد تشريح.
الاستفادة المثلى من كل هذه المعايير تمكن من تحريض على التقوية استنساخه جدا ومستقرة جدا على المدى الطويل. هذه المنهجية توفر إمكانية مواصلة استكشاف الآليات الجزيئية المشاركة في زيادة مستقرةفي قوة متشابك في شرائح قرن آمون. كما يسلط الضوء على أهمية الظروف التجريبية في المختبر التحقيق في الظواهر العصبية.
Introduction
في الوقت الحاضر، هناك فهم محدود من كيفية تخزين الذكريات معقدة وأشار على مستوى الدوائر العصبية. ومع ذلك، فإن فرضية توحيد تخزين الذاكرة متاحة ومقبولة على نطاق واسع: يتم تخزين ذكريات عن التغيرات في قوة الاتصالات المشبكية بين الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي. من تلقاء نفسها، وقد استفاد البحث عن اللدونة متشابك إلى حد كبير من اثنين من الاكتشافات. (1) وجدت تجربة المنوية، النعيم وومو 1، وذلك باستخدام أرنب تخدير سليمة، وفي هذا تسليم قصيرة عالية التردد (1 ثانية، 100 هرتز) التحفيز على مسار الثاقب من الحصين تسبب طويل الأمد (عدة ساعات) زيادة في اتصالات متشابك ذات الصلة. كان يطلق على هذه الظاهرة الرائعة "الكمونية طويلة الأمد" أو الكمونية من قبل دوغلاس وغودارد في عام 1975 2. (2) في وقت لاحق، تبين أن ظاهرة مماثلة يمكن أن تسبب في شرائح الدماغ (0.4 ملم) الحفاظ بشكل مصطنع على قيد الحياة في المختبر </eم>. وقد لوحظ الكمونية الأكثر دراسة على نطاق واسع في المختبر من خلال تقديم واحدة أو عدة الكزازية إلى مجموعة من المحاور (ما يسمى الضمانات شيفر) أثناء تسجيل الناتجة حقل إمكانات متشابك مثير أثار في الخلايا العصبية الهرمية من ما يسمى المنطقة CA1. إلى حد كبير وكشفت آليات الكمونية الاستقراء. أساسا، كا 2 + تدفق من خلال المستقبلات NMDA ينشط الإنزيمات مع نتيجتان: أ الفسفرة من مستقبلات أمبا (والتي تزيد كفاءتها)، وإدماج مستقبلات أمبا اضافية في الغشاء بعد المشبكي 3. على النقيض من ذلك، فإن آليات للمرحلة صيانة الكمونية غير معروفة إلى حد كبير، وخاصة لأنه أكثر صعوبة بكثير تجريبيا للحفاظ على شريحة صحية لعدة ساعات من لمدة 30 إلى 60 دقيقة.
وقد تم تخصيص الكثير من الدراسات لفهم آليات الكمونية ونظريات مثيرة للاهتمام قد وضعت على مدى السنوات 4-11. ولكن الأمم المتحدةسمسم الآن، لم يتم توضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء زيادة دقيقة مستقرة في قوة متشابك. هذا قد يكون عائدا جزئيا إلى صعوبة استخراج النتائج السابقة في مختبرات مختلفة باستخدام تقنيات مختلفة لإعداد والحفاظ على شرائح الحصين. في ورقة منهجيتها، Sajikumar وآخرون. 12 وشدد على أهمية الظروف التجريبية لإعداد شرائح قرن آمون الفئران وتسجيل الكمونية مستقرة. في هذا الفيديو نقدم جميع الخطوات الأمثل وضعت في المختبر لدينا على مر السنين لتكون قادرة على تسجيل الكمونية مستقرة جدا في شرائح الحصين الماوس.
وقد أحرز هذا التحسين من البروتوكولات التي وضعت واستخدمت بنجاح من قبل مختبرات أخرى التي تدرس آليات الكمونية في الفئران والجرذان 13 11. فإنه يسمح للباحثين من ذوي الخبرة للحث وتسجيل الكمونية طويلة الأمد جدا في الفئران البالغة مع نسبة عالية من النجاح. عتم فحص أساس hysiological من صنع الكمونية بعناية وأظهرت 14. في هذه الورقة منهجية، وتبين لنا أن أي تعديلات من الظروف التجريبية، مثل درجة الحرارة أو الأوكسجين يمكن أن يكون لها تأثير عميق على صيانة الكمونية في حين يمكن إجراء تشريح تعديل عميق شرائح استثارة. ولا بد أيضا من التأكيد على أن مراقبة دقيقة من كل هذه المعايير يتطلب تدريب عدة أشهر للطلاب المبتدئين.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد وضعنا في المختبر لدينا بروتوكول الناجمة عن مزيج من الأساليب المتقدمة والمستخدمة من قبل مختبرات أخرى وجود خبرة كبيرة في الكمونية التسجيلات 11،17. ويتم تكييف هذا البروتوكول لالحصين الماوس الكبار، ويمكن استخدامها في الحيوانات في أي عمر ولأي الوراثي الخلفية. ك?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر برنار Foucart للحصول على المساعدة الفنية. وأيد هذا العمل من قبل الصندوق البلجيكي للبحوث العلمية (FRS-FNRS) وصندوق الملكة إليزابيث للبحوث الطبية. أنياس فيير هو زميل باحث في الصندوق البلجيكي للبحوث العلمية.
Materials
| Reagent/Material | |||
| NaCl | Sigma – Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma – Aldrich | S8875 | |
| KCl | Sigma – Aldrich | P9333 | |
| D-glucose | Sigma – Aldrich | G7528 | |
| NaH2PO4 | Sigma – Aldrich | S9638 | |
| MgSO4 1M | Sigma – Aldrich | 63126 | |
| CaCl2 | Sigma – Aldrich | C4901 | |
| Carbogen | Air Liquide (Belgium) | ||
| Capillaries | WPI, Inc. (UK) | TW150-4 | |
| Stimulating Electrodes | FHC (USA) | CE2B30 | |
| Surgical tools | FST (Germany) | ||
| Filter paper 84 g/m2 | Sartorius | FT-3-105-110 | |
| Mesh | Lycra | 15 den | |
| Glue | UHU | plus endfest300 | |
| Instrument | |||
| Amplifier | WPI, Inc. (UK) | ISO-80 | |
| Interface recording chamber | FST (Germany) | ||
| Peristaltic pumps | Gilson (USA) | Minipuls 3 | |
| Temperature controller | University of Edinburgh | www.etcsystem.com | |
| Tissue Chopper | Mcllwain | ||
| Stimulators | Grass (USA) | S88X + SIU-V | |
| Program analysis | WinLTP | www.winltp.com | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 and MMO-220A | |
| Surgical microscope | Leica Microsystem | ||
| A/D converter | National Instruments | NIPCI-6229 M-series |
References
- Bliss, T. V., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232 (2), 331-356 (1973).
- Douglas, R. M., Goddard, G. V. Long-term potentiation of the perforant path-granule cell synapse in the rat hippocampus. Brain Res. 86, 205-215 (1975).
- Squire, L., Kandel, E. . Memory: From mind to molecules. , (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265 (5175), 1104-1107 (1994).
- Frey, U., Morris, R. G. Synaptic tagging and long-term potentiation. Nature. 385 (6616), 533-536 (1038).
- Bortolotto, Z. A., Collingridge, G. L. A role for protein kinase C in a form of metaplasticity that regulates the induction of long-term potentiation at CA1 synapses of the adult rat hippocampus. Eur. J. Neurosci. 12 (11), 4055-4062 (2000).
- Migues, P. V., Hardt, O., et al. PKMzeta maintains memories by regulating GluR2-dependent AMPA receptor trafficking. Nat. Neurosci. 13 (5), 630-634 (2010).
- Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. -. C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54 (3), 447-460 (2007).
- Vickers, C. A., Dickson, K. S., Wyllie, D. J. A. Induction and maintenance of late-phase long-term potentiation in isolated dendrites of rat hippocampal CA1 pyramidal neurones. J. Physiol. 568 (3), 803-813 (2005).
- Fonseca, R. Activity-dependent actin dynamics are required for the maintenance of long-term plasticity and for synaptic capture. Eur. J. Neurosci. 35 (2), 195-206 (2012).
- Redondo, R. L., Okuno, H., Spooner, P. A., Frenguelli, B. G., Bito, H., Morris, R. G. M. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J. Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 15 (5), 607-613 (2005).
- Connor, S. A., Wang, Y. T., Nguyen, P. V. Activation of beta-adrenergic receptors facilitates heterosynaptic translation-dependent long-term potentiation. J. Physiol. 589 (17), 4321-4340 (2011).
- Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Long-lasting LTP requires neither repeated trains for its induction nor protein synthesis for its development. PLoS One. 7 (7), e40823 (2012).
- Capron, B., Sindic, C., Godaux, E., Ris, L. The characteristics of LTP induced in hippocampal slices are dependent on slice-recovery conditions. Learn. Mem. 13 (3), 271-277 (2006).
- Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Late phase of L-LTP elicited in isolated CA1 dendrites cannot be transferred by synaptic capture. Neuroreport. 21, 210-215 (2010).
- Nguyen, P. V., Kandel, E. R. Brief theta-burst stimulation induces a transcription-dependent late phase of LTP requiring cAMP in area CA1 of the mouse hippocampus. Learn. Mem. 4 (2), 230-243 (1997).
- Dewachter, I., Ris, L., et al. Modulation of synaptic plasticity and Tau phosphorylation by wild-type and mutant presenilin1. Neurobiol. Aging. 29 (5), 639-652 (2008).
- Dewachter, I., Filipkowski, R. K., et al. Deregulation of NMDA-receptor function and down-stream signaling in APP[V717I] transgenic mice. Neurobiol. Aging. 30 (2), 241-256 (2009).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology. J. Vis. Exp. (49), e2330 (2011).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
- Alger, B. E., Dhanjal, S. S., Dingledine, R., Garthwaite, J., Henderson, G., King, G. L., Dingledine, R., et al. Appendix: Brain slice methods. Brain Slices. , 381-437 (1984).
- Watson, P. L., Weiner, J. L., Carlen, P. L. Effects of variations in hippocampal slice preparation protocol on the electrophysiological stability, epileptogenicity and graded hypoxia responses of CA1 neurons. Brain Res. 775, 134-143 (1997).
- Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. Anisomycin, an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro. Brain Res. 452 (1-2), 57-65 (1988).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Fonseca, R., Nägerl, U. V., Bonhoeffer, T. Neuronal activity determines the protein synthesis dependence of long-term potentiation. Nat. Neurosci. 9 (4), 478-480 (2006).
- Rudy, J. W. Is there a baby in the bathwater? Maybe: some methodological issues for the de novo protein synthesis hypothesis. Neurobiol. Learn. Mem. 89 (3), 219-224 (2008).
- Sharma, A. V., Nargang, F. E., Dickson, C. T. Neurosilence: Profound Suppression of Neural Activity following Intracerebral Administration of the Protein Synthesis Inhibitor Anisomycin. J. Neurosci. 32 (7), 2377-2387 (2012).
- Volianskis, A., Jensen, M. S. Transient and sustained types of long-term potentiation in the CA1 area of the rat hippocampus. J. Physiol. 550 (2), 459-492 (2003).
- Ris, L., Villers, A., Godaux, E. Synaptic capture-mediated long-lasting long-term potentiation is strongly dependent on mRNA translation. Neuroreport. 20 (17), 1572-1576 (2009).
- Abbas, A. -. K., Dozmorov, M., et al. Persistent LTP without triggered protein synthesis. Neurosci. Res. 63 (1), 59-65 (2009).
- Ho, O. H., Delgado, J. Y., O’Dell, T. J. Phosphorylation of proteins involved in activity-dependent forms of synaptic plasticity is altered in hippocampal slices maintained in vitro. J. Neurochem. 91, 1344-1357 (2004).
- Whittingham, T. S., Lust, W. D., Christakis, D. A., Passonneau, J. V. Metabolic stability of hippocampal slice preparations during prolonged incubation. J. Neurochem. 43, 689-696 (1984).
- Dunlop, D. S., van Elden, W., Lajtha, A. Optimal conditions for protein synthesis in incubated slices of rat brain. Brain Res. 99, 303-318 (1975).
- Taubenfeld, S. M., Stevens, K. A., Pollonini, G., Ruggiero, J., Alberini, C. M. Profound molecular changes following hippocampal slice preparation: loss of AMPA receptor subunits and uncoupled mRNA/protein expression. J. Neurochem. 81 (6), 1348-1360 (2002).
- Gruart, A., Munoz, M. D., Delgado-Garcia, J. M. Involvement of the CA3-CA1 synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice. J. Neurosci. 26 (4), 1077-1087 (2006).
- Whitlock, J. R., Heynen, A. J., Shuler, M. G., Bear, M. F. Learning induces long-term potentiation in the hippocampus. Science. 313, 1093-1097 (2006).
- Grant, S. G. N., Silva, A. J. Targeting learning. TINS. 17 (2), 71-75 (1994).
- Izquierdo, I., Medina, J. H., Vianna, M. R. M., Izquierdo, L. A., Barros, B. M. Separate mechanisms for short- and long-term memory. Behav. Brain Res. 103, 1-11 (1999).
- Morice, E., Andreae, L. C., Cooke, S. F., Vanes, L., Fisher, E. M. C., Tybulewicz, V. L. J., Bliss, T. V. P. Preservation of long-term memory and synaptic plasticity despite short-term impairments in the Tc1 mouse model of Down syndrome. Learn Mem. 15 (7), 492-500 (2008).
- Dunlop, D. S., van Elden, W., Plucinska, I., Lajtha, A. Brain Slice Protein Degradation and Development. J. Neurochem. 36, 258-265 (1981).
- Izquierdo, I. Long-term potentiation and the mechanisms of memory. Drug Dev. Res. 30, 1-17 (1993).
