Ingeniería de tejidos de un humano 3D<em> In vitro</em> Sistema de Prueba de Tumores
Summary
Se describen los métodos para crear los tejidos tumorales 3D humanos como sistemas de prueba. Estas tecnologías se basan en un descelularizado Biológica vascularizado Andamios (BioVaSc), las células humanas primarias y una línea de células tumorales, que pueden ser cultivadas bajo condiciones estáticas, así como en condiciones dinámicas en un biorreactor de flujo.
Abstract
El cáncer es una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Estrategias terapéuticas actuales se desarrollan principalmente en los sistemas de cultivo en 2D, que reflejen adecuadamente las condiciones fisiológicas in vivo. 3D matrices biológicas proporcionan células un ambiente en el cual las células pueden auto-organizarse, lo que permite el estudio de la organización del tejido y la diferenciación celular. Tales andamios se pueden sembrar con una mezcla de diferentes tipos de células para estudiar-interacciones célula-célula directos 3D. Para imitar la complejidad 3D de tumores de cáncer, nuestro grupo ha desarrollado un sistema de prueba 3D in vitro tumor.
Nuestros modelos de sistemas de ensayo de tejido 3D la situación in vivo de tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos (MPNSTs), que hemos establecido con nuestros descelularizado segmento yeyunal porcino andamio vascularizado biológico derivado (BioVaSc). En nuestro modelo, nos volvieron a sembrar una matriz BioVaSc modificado con fibroblastos primarios, células endoteliales microvasculares (MVECs) y la línea de células tumorales S462. Para la cultura estática, se retira la estructura vascular del BioVaSc y el andamio restante se corta en un lado (Intestino Delgado Submucosa SIS-Muc). La matriz resultante se fija entonces entre dos anillos de metal (coronas de células).
Otra opción es la cultura el sembrado de células SIS-Muc en un sistema de biorreactor de flujo que expone las células a la tensión de cizallamiento. Aquí, el biorreactor está conectado a una bomba peristáltica en un incubador de auto-construido. Un equipo que regula el oxígeno arterial y el suministro de nutrientes a través de parámetros como la presión arterial, la temperatura y el caudal. Esta configuración permite una cultura dinámica, ya sea con pulsátil presión regulada o flujo constante.
En este estudio, se podría establecer con éxito tanto un sistema de cultivo 3D estática y dinámica para MPNSTs. La capacidad de modelar los tumores de cáncer en un entorno 3D más natural permitirá el descubrimiento, prueba y validación defuturos fármacos en un modelo similar a la humana.
Introduction
Nuevos productos farmacéuticos deben ser validadas en lo que respecta a su calidad, seguridad y eficacia antes de la autorización de comercialización. Hasta la fecha, los experimentos con animales son el método estándar para las pruebas de drogas y validación. Sin embargo, debido a las diferencias específicas de las especies, los experimentos con animales a menudo no ampliamente evaluar el efecto de los compuestos en los seres humanos 1. Por esta razón, es importante para generar modelos de tejidos humanos que se pueden utilizar para ensayos in vitro de nuevos medicamentos y sustancias.
Uno de los ejes de nuestro grupo es la creación de modelos de ensayo in vitro in con nuestro andamio biológico vascularizado (BioVaSc) 2,3. El BioVaSc se puede utilizar como un sistema de matriz 3D estática o dinámica. Para la cultura estática, el segmento yeyunal porcino descelularizado (Small intestinal submucosa SIS-Muc) se coloca en un inserto de metal para la resiembra de la célula. Diversas células, como el cáncer y las células endoteliales se pueden cultivar en el andamio.
<pclase = "jove_content"> Para el cultivo dinámico, la BioVaSc está unido a un sistema de biorreactor de flujo que se aplica a lo largo de la vasculatura o en toda la superficie del andamio. Biorreactores actuales aplicar estímulos biológicos, mecánicos, eléctricos o que actúan sobre la diferenciación o proliferación de las células 4. Para biorreactores en el campo de la ingeniería de tejidos, el concepto básico es para simular las condiciones en el cuerpo humano. En el que, las células se les proporciona un entorno natural en el que pueden interactuar entre sí y con su matriz extracelular circundante. Para la producción de sistemas in vitro o trasplantes de prueba en, la capacidad para imitar el entorno natural de las células con una estructura de soporte adecuada y un sistema biorreactor es crítico 5. Por lo tanto, los dispositivos más complejos y técnicamente exigentes deben desarrollarse con el fin de cumplir con estas tareas 6.Además, es posible utilizar nuestro andamiaje para el establdantes de un modelo vascularizado debido a las estructuras tubulares conservados, que incluyen la arteria de alimentación, vena, y la cama capilar de conexión. Todas las células de porcino necesitan ser eliminado por descelularización química, mecánica y enzimática, y la gamma-esterilizada andamio. Las estructuras vasculares tubulares restaurados posteriormente pueden volver a sembrarse con células endoteliales microvasculares humanas utilizando un biorreactor de perfusión de recirculación 7, que imita los parámetros biomecánicos y / o bioquímicas tales como el pH, la temperatura, la presión, el suministro de nutrientes y eliminación de desechos 6. El re-endotelización de las estructuras tubulares crea un humano equivalente de vasos sanguíneos dentro de la 3,7 andamio de colágeno. En el siguiente paso, la superficie de los antiguos lumen (mucosa) se puede sembrar con células humanas primarias para establecer co-cultivos 3,7,8.
En este estudio un sistema de prueba de tumor 3D está configurado por el co-cultivo de una línea celular tumoral con vía primariacélulas ROMAL en condiciones estáticas y dinámicas en el SIS-Muc.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cuando la comparación de sistemas de cultivo 2D y 3D en la investigación del tumor, los sistemas de 3D, a pesar de ser el enfoque más caro, han demostrado para imitar las condiciones en microambientes biológicos mejor. Se pudo demostrar que algunas células tumorales crecen mucho más lento en un cultivo 3D que en 2D una cultura común 12, que es de acuerdo a la situación en un tumor real. Bissell y colaboradores demostraron en su trabajo que el comportamiento de las células cancerígenas de mama refleja la situación in vivo, incluyendo la morfología celular y la señalización, con mayor precisión cuando una cultura 3D dentro de una matriz ofrece las interacciones célula-ECM. Además, hicieron hincapié en la importancia del medio ambiente extracelular en 3D mediante la demostración de que los cambios en las interacciones ambientales llevaron a la reversión de las células malignas a un fenotipo normal. Además, y más importante aún, estos resultados también podrían ser confirmados en modelos animales in vivo 10,11.
ontenido "> La comparación directa de los experimentos in vivo en animales y en modelos in vitro de tejidos revela las ventajas y desventajas de ambos sistemas. Una de las ventajas de los modelos in vitro es el permiso de un tiempo real, mucho mejor o imágenes fijas mediante microscopía. Una limitación es que que imitan las condiciones estáticas o de corto plazo, mientras que los sistemas in vivo con frecuencia progresan. La actual falta de vascularización y el transporte normal de las moléculas pequeñas, sede de la respuesta inmune, y otras interacciones célula-célula son otras desventajas de los modelos in vitro 12. Por lo tanto, en 3D sistemas in vitro como se presenta en este estudio ofrecen una adición prometedora a los experimentos con animales. Proporcionan una mejor comparabilidad con el organismo humano y por lo tanto minimizar las malas interpretaciones experimentales. Biomimetic en sistemas de modelos in vivo será por tanto ser más relevante para estudiar la forma depende de cáncer y metástasis en condiciones microambientales que regulan tumorigenesis 11.Nuestro estudio muestra que el entorno en 3D proporcionado por el SIS-Muc conduce a una formación más similar a un tumor de tejido de células, que no se observa en el cultivo de células 2D común (véase la Figura 3A). Por otra parte, el uso de células primarios derivados de biopsias de tumores es un paso muy importante hacia la medicina personalizada, una disciplina que tiene como objetivo identificar el mejor tratamiento en función de las necesidades individuales del paciente. La incorporación de las células tumorales específicos para cada paciente primarias aisladas de material de biopsia permitirá en las pruebas in vitro de estrategias terapéuticas. Tales sistemas de prueba hará posible investigar diferentes fármacos y combinaciones de los mismos en un tiempo-y cribado de alto rendimiento de ahorro de costes. Además, la integración de las células estromales asociadas a tumores como se muestra en este estudio es importante para el enfoque personalizado, ya que la progresión del tumor influencias del microentorno de un tumor 13 y podría resultar como suitable diana terapéutica.
Alternativamente a un enfoque personalizado, nuestro modelo de tumor puede ser modificado para servir como un sistema de prueba de tumor generalizada por la incorporación de líneas celulares tumorigénicas establecidas. Se trata de una adaptación prometedora para fines de investigación básica. Por tanto las pruebas de drogas se acerca se requiere la presencia de una estructura vascular para probar la distribución y absorción de las sustancias terapéuticas. La matriz-SIS Muc permite la siembra basolateral con MVEC primaria para los estudios de barrera de absorción, la resiembra de las estructuras vasculares conservados de la BioVaSc mejorará aún más el estudio de la administración de fármacos.
Con el fin de crear modelos de tejido, una matriz biodegradable 3D se puede utilizar como marco para un co-cultivo de diferentes tipos de células 14. El uso de tales matrices en 3D es a menudo limitada por la ausencia de una vascularización funcional. Este problema puede ser resuelto por el uso de la BioVaSc, que ofrece conservado str vaso sanguíneouctures, que puede ser resembrado con células endoteliales. Además, la BioVaSc proporciona componentes extracelulares, que aseguran la adherencia de las células y facilitar la diferenciación del tejido. También permite a la función específica de tejido de largo plazo de los tejidos bioartificiales 3D 7,8,15. El requisito previo para la ingeniería de sustitutos vasculares funcionales es la imitación de fisiológica humana y las condiciones biomecánicas. Por lo tanto, los sistemas de biorreactores, que pueden poner en práctica estos requisitos in vitro, son de gran interés para la creación de modelos de tumores biológicos.
La combinación de la BioVaSc, la tecnología de biorreactor y el co-cultivo de diferentes tipos de células es un método muy prometedor para generar tejidos tumorales vascularizadas, lo que permitirá el estudio de los mecanismos pertinentes para la progresión del cáncer, como la angiogénesis y la metástasis. Vemos este tipo de modelos de tumores como un enfoque prometedor para complementar los estudios en animales al proporcionar un equivalentea la fisiología del tumor humano.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean dar las gracias a Jan Hansmann (Fraunhofer IGB, Stuttgart) por su apoyo técnico para desarrollar biorreactores y la incubadora biorreactor.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Collagenase solution | SERVA | 17454 | (500 U/ml) |
| Dispase solution | Gibco | 17105-041 | (2.0 U/ml) |
| DMEM, high-glucose | PAA | G0001,3010 | |
| DNase | ROCHE | 10104159001 | 200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep |
| DZ solution | Roth | 3484.2 | 34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water |
| FCS | LONZA | DE14-801F | |
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| medical pressure transducer | MEMSCAP | SP844 | |
| monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor | DAKO Cytomation | M0616 | Clone F8/86 0.12 μg/ml |
| mouse monoclonal anti-human p53 | DAKO Cytomation | IS616 | Clone DO-7 ready-to-use |
| peristaltic pump | Ismatec | ||
| sterile disposable dome | MEMSCAP | 844-28 | |
| Trypsin / EDTA solution | PAA | L11-003 | 0,05% |
| VascuLife (VEGF-Mv) | Lifeline | LL-0003 | |
| Versene | Gibco | 15040-033 |
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