génie tissulaire d'un être humain 3D<em> In vitro</em> Système de tumeur de test
Summary
Méthodes pour créer des tissus tumoraux humains 3D comme systèmes d'essai sont décrits. Ces technologies sont basées sur un échafaudage décellularisé biologique vascularisé (BioVaSc), les cellules primaires humaines et d'une lignée cellulaire tumorale, qui peut être cultivée dans des conditions statiques ainsi que dans des conditions dynamiques dans un bioréacteur d'écoulement.
Abstract
Le cancer est l'une des principales causes de décès dans le monde. Les stratégies thérapeutiques actuelles sont principalement développées dans les systèmes de culture en 2D, qui reflètent mal les conditions physiologiques in vivo. Matrices 3D biologiques fournissent les cellules d'un environnement dans lequel les cellules peuvent s'auto-organiser, permettant l'étude de l'organisation des tissus et la différenciation cellulaire. Ces échafaudages peuvent être ensemencées avec un mélange de différents types de cellules pour étudier cellule-cellule 3D-interactions directes. Pour imiter la complexité 3D de tumeurs cancéreuses, notre groupe a mis au point un système 3D in vitro d'une tumeur de test.
Nos modèles de systèmes de test de tissu 3D la situation in vivo de tumeurs malignes nerveux périphériques de la gaine (de MPNST), que nous avons établies avec nos décellularisée secteur du jéjunum de porc d'échafaudage vascularisé biologique dérivé (BioVaSc). Dans notre modèle, nous réensemencer une matrice BioVaSc modifié avec des fibroblastes primaires, des cellules endothéliales microvasculaires (mvECs) et la lignée cellulaire de tumeur S462. Pour la culture statique, la structure vasculaire du BioVaSc est retiré et l'échafaudage est découpé restant ouvert d'un côté (petite sous-muqueuse intestinale Muc-SIS). La matrice résultante est ensuite fixé entre les deux anneaux métalliques (couronnes de cellules).
Une autre option est de culture de la cellule tête de série, Muc-SIS dans un système de bioréacteur d'écoulement qui expose les cellules à des contraintes de cisaillement. Ici, le bioréacteur est raccordé à une pompe péristaltique dans un incubateur à auto-construit. Un ordinateur régule l'oxygène artériel et la fourniture des nutriments par l'intermédiaire des paramètres tels que la pression artérielle, la température et le débit. Cette configuration permet une culture dynamique soit pulsatile de la pression régulée ou débit constant.
Dans cette étude, nous avons pu établir avec succès à la fois un système de culture 3D statique et dynamique pour MPNST. La capacité à modéliser les tumeurs cancéreuses dans un environnement 3D plus naturel permettra à la découverte, le test et la validation deproduits pharmaceutiques à venir dans un modèle humain-comme.
Introduction
Nouveaux produits pharmaceutiques doivent être validés en ce qui concerne leur qualité, la sécurité et l'efficacité avant l'autorisation de commercialisation. À ce jour, l'expérimentation animale sont la méthode standard pour le dépistage des drogues et de validation. Toutefois, en raison des différences spécifiques à l'espèce, l'expérimentation animale, souvent, ne permettent pas d'évaluer complètement l'effet des composés chez l'homme 1. Pour cette raison, il est important de générer des modèles de tissu humain qui peuvent être utilisés pour des tests in vitro de nouveaux médicaments et de substances.
L'un des axes de notre groupe est la création de modèles in vitro d'essai dans notre échafaudage avec vascularisé biologique (BioVaSc) 2,3. Le BioVaSc peut être utilisé comme un système de matrice 3D statique ou dynamique. Pour la culture statique, le segment de jéjunum de porc décellularisé (petite sous-muqueuse intestinale Muc-SIS) est placé dans un insert métallique pour le réensemencement des cellules. Diverses cellules, telles que le cancer et les cellules endotheliales peuvent être cultivées sur l'échafaudage.
<pclass = "jove_content"> Pour la culture dynamique, la BioVaSc est attaché à un système de bioréacteur que s'applique l'écoulement dans tout le système vasculaire ou à travers la surface de l'échafaudage. Bioréacteurs actuels mettent en œuvre des stimuli biologiques, mécaniques, ou électriques qui agissent sur la différenciation ou de la prolifération des cellules 4. Pour bioréacteurs dans le domaine de l'ingénierie tissulaire, le concept de base est de simuler les conditions dans le corps humain. Dans lequel, les cellules sont fournies un milieu naturel dans lequel ils peuvent interagir les uns avec les autres et leur matrice extracellulaire environnant. Pour la production de systèmes in vitro ou transplantations de test dans, la capacité d'imiter l'environnement naturel des cellules avec une structure de support appropriée et le système de bioréacteur est essentiel 5. Par conséquent, des dispositifs plus complexes et techniquement exigeants doivent être développées afin de s'acquitter de ces tâches 6.Il est en outre possible d'utiliser notre échafaudage pour l'établinfligés aux vascularisé un modèle en raison des structures tubulaires, qui comprennent conservés l'artère d'alimentation, de la veine, et le lit capillaire de liaison. Toutes les cellules porcines ont besoin d'être enlevé par décellularisation chimique, mécanique et enzymatique, et l'échafaudage gamma-stérilisé. Les structures tubulaires vasculaires peuvent ensuite être restaurées réensemencées avec des cellules endotheliales microvasculaires humaines en utilisant un bioréacteur à perfusion recirculation 7, qui imite les paramètres biomécaniques et / ou biochimiques, tels que le pH, la température, la pression, l'alimentation en substances nutritives et l'enlèvement des déchets 6. La ré-endothélialisation des structures tubulaires crée un équivalent humain d'un vaisseau sanguin à l'intérieur de l'échafaudage de collagène 3,7. Dans l'étape suivante, la surface des anciens lumière (muqueuse) peut être ensemencée avec des cellules humaines primaires d'établir des co-cultures 3,7,8.
Dans cette étude, un système de test de la tumeur 3D est mis en place par co-culture d'une lignée de cellules de tumeur primaire avec stcellules Romal dans des conditions statiques et dynamiques sur le SIS-Muc.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lorsque l'on compare 2D et 3D des systèmes de culture dans la recherche de la tumeur, les systèmes 3D, en dépit d'être l'approche la plus coûteuse, se sont avérés mieux reproduire les conditions de micro-environnements biologiques. On a pu montrer que certaines cellules tumorales se développent beaucoup plus lentement dans une culture en 3D par rapport à une culture 2D commun 12, qui est conforme à la situation dans un véritable tumeur. Bissell et collaborateurs ont montré dans leur travail que le comportement des cellules cancérigènes du sein correspond à la situation in vivo, y compris la morphologie cellulaire et de signalisation, et plus précisément quand une culture en 3D au sein d'une matrice propose des interactions cellule-ECM. En outre, ils ont souligné l'importance de l'environnement extracellulaire en 3D en démontrant que les changements dans les interactions environnementales ont conduit à la réversion des cellules malignes à un phénotype normal. En outre et surtout, ces résultats peuvent également être confirmées dans des modèles animaux in vivo 10,11.
ontenu "> La comparaison directe des expériences in vivo sur les animaux et dans les modèles de tissus in vitro révèle des avantages et des inconvénients dans les deux systèmes. L'un des avantages des modèles in vitro est la permission d'un temps réel beaucoup mieux ou imagerie fixe par microscopie. Une limitation est que ils imitent conditions statiques ou à court terme, alors que les systèmes in vivo progressent souvent. L'absence actuelle de système vasculaire et le transport normal de petites molécules, accueillir les réponses immunitaires, et d'autres interactions cellulaires sont d'autres inconvénients des modèles in vitro 12. Par conséquent, 3D dans des systèmes in vitro tel que présenté dans cette étude offrent des perspectives prometteuses à l'expérimentation animale. Ils offrent une meilleure comparabilité de l'organisme humain et donc de minimiser les erreurs d'interprétation expérimentales. biomimétique dans des systèmes modèles in vivo sera donc devenir plus pertinent d'étudier la façon dont le cancer et les métastases dépendent sur les conditions micro-environnementales qui régissent tumorigenesis 11.Notre étude montre que l'environnement 3D fournie par le SIS-Muc conduit à une formation de tumeur plus semblable à un tissu de cellules, qui n'est pas observée dans la culture de cellule commun 2D (voir la figure 3A). En outre, l'utilisation de cellules primaires dérivées de biopsies de tumeurs est une étape très importante vers une médecine personnalisée, une discipline qui vise à identifier le meilleur traitement en fonction des besoins individuels du patient. Incorporant des cellules tumorales spécifiques au patient primaires isolées à partir de matériel de biopsie permettra de tests in vitro des stratégies thérapeutiques. Ces systèmes de test, il sera possible d'étudier les différentes drogues et leurs combinaisons en un temps et criblage à haut débit de réduction des coûts. En outre, l'intégration de cellules stromales associées à la tumeur comme le montre cette étude est importante pour l'approche personnalisée, puisque la progression des influences microenvironnement de la tumeur de la tumeur 13 et pourrait se révéler comme Conviecible thérapeutique le.
En variante à une approche personnalisée, notre modèle de tumeur peut être modifié pour servir de système de test de la tumeur généralisée par l'incorporation des lignées cellulaires tumorigènes établies. Il s'agit d'une adaptation prometteuse à des fins de recherche fondamentale. À la fois pour le dépistage de drogues se rapproche de la présence d'une structure vasculaire est nécessaire de tester la répartition et l'absorption de substances thérapeutiques. La matrice de SIS-Muc permet l'ensemencement avec basolatérale primaire MVEC pour les études d'absorption de la barrière, le réensemencement des structures vasculaires préservés de la BioVaSc permettra d'améliorer encore l'étude de l'administration de médicaments.
Afin de créer des modèles de tissu, une matrice biodégradable 3D peut être utilisé en tant que cadre pour une co-culture de différents types de cellules 14. L'utilisation de telles matrices 3D est souvent limitée par l'absence de vascularisation fonctionnelle. Ce problème peut être résolu par l'utilisation de la BioVaSc, qui offre str conservé de vaisseau sanguinuctures, qui peuvent être ensemencés avec des cellules endotheliales. En outre, la BioVaSc fournit des composants extracellulaires, qui assurent l'adhérence des cellules et de faciliter la différenciation des tissus. Il permet également la fonction spécifique des tissus de longue date de tissus 3D bioartificiel 7,8,15. La condition préalable pour l'ingénierie de substituts vasculaires fonctionnelles est l'imitation de physiologique humain et les conditions biomécaniques. Par conséquent, les systèmes de bioréacteurs, qui peut mettre en œuvre ces exigences in vitro, sont d'un intérêt extrême pour la création de modèles de tumeurs biologiques.
La combinaison de la BioVaSc, la technologie de bioréacteur et de la co-culture de différents types de cellules est un procédé très prometteur pour produire des tissus de tumeurs vascularisées, ce qui permettra l'étude des mécanismes pertinents pour la progression du cancer tels que l'angiogenèse et la métastase. Nous voyons ces modèles tumoraux comme une approche prometteuse pour compléter les études animales en fournissant un équivalentà la physiologie de la tumeur humaine.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Jan Hansmann (Fraunhofer IGB, Stuttgart) pour son appui technique pour élaborer des bioréacteurs et l'incubateur de bioréacteur.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Collagenase solution | SERVA | 17454 | (500 U/ml) |
| Dispase solution | Gibco | 17105-041 | (2.0 U/ml) |
| DMEM, high-glucose | PAA | G0001,3010 | |
| DNase | ROCHE | 10104159001 | 200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep |
| DZ solution | Roth | 3484.2 | 34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water |
| FCS | LONZA | DE14-801F | |
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| medical pressure transducer | MEMSCAP | SP844 | |
| monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor | DAKO Cytomation | M0616 | Clone F8/86 0.12 μg/ml |
| mouse monoclonal anti-human p53 | DAKO Cytomation | IS616 | Clone DO-7 ready-to-use |
| peristaltic pump | Ismatec | ||
| sterile disposable dome | MEMSCAP | 844-28 | |
| Trypsin / EDTA solution | PAA | L11-003 | 0,05% |
| VascuLife (VEGF-Mv) | Lifeline | LL-0003 | |
| Versene | Gibco | 15040-033 |
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