Tissue Engineering van een Menselijke 3D<em> In vitro</em> Tumor Test System
Summary
Methoden om menselijke 3D tumorweefsels maken als testsystemen worden beschreven. Deze technologieën zijn gebaseerd op een van cellen ontdane biologische Gevasculariseerd Steiger (BioVaSc), primaire humane cellen en tumor cellijn, die kan worden gekweekt in statische als onder dynamische omstandigheden in een stroom bioreactor.
Abstract
Kanker is een van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd. Huidige therapeutische strategieën worden voornamelijk ontwikkeld in 2D cultuur systemen, die onvoldoende weerspiegelen fysiologische condities in vivo. Biologische 3D matrices cellen een omgeving waarin cellen kunnen zelf organiseren, zodat de studie van weefselorganisatie en celdifferentiatie. Dergelijke draagstructuren kunnen worden geënt met een mengsel van verschillende celtypes om direct 3D cel-cel-interacties te bestuderen. Om het 3D complexiteit van kanker tumoren na te bootsen, heeft onze groep een 3D in vitro tumor testsysteem ontwikkeld.
Onze 3D weefsel testsysteem modellen de in vivo situatie van maligne perifere zenuw schede tumoren (MPNSTs), die we gelegd met onze gedecellulariseerde varkens jejunal segment afgeleid biologische gevasculariseerde steiger (BioVaSc). In ons voorbeeld hebben we een gemodificeerde reseeded BioVaSc matrix met primaire fibroblasten, microvasculaire endotheelcellen (MVEC's) en de S462 tumorcellijn. Voor statische cultuur, wordt de vasculaire structuur van de BioVaSc verwijderd en de resterende steiger opengesneden aan een zijde (dunne darm Submucosa SIS-Muc). De resulterende matrix wordt vervolgens gefixeerd tussen twee metalen ringen (cel kronen).
Een andere optie is om de cel kweek geplaatste SIS-Muc in een stroom bioreactor systeem dat de cellen bloot schuifspanning. Hier wordt de bioreactor verbonden met een peristaltische pomp in een zelf vervaardigd incubator. Een computer regelt de arteriële zuurstof en voedingsstoffen leveren via parameters zoals bloeddruk, temperatuur en debiet. Deze opstelling zorgt voor een dynamische cultuur met ofwel druk geregeld pulserende of constante stroom.
In deze studie konden wij met succes zowel statische als dynamische 3D kweeksysteem voor MPNSTs stellen. De mogelijkheid om tumoren modelleren in een meer natuurlijke 3D-omgeving zal de ontdekking, het testen en valideren van de staattoekomstige geneesmiddelen in een mens-achtig model.
Introduction
Nieuwe geneesmiddelen moeten worden gevalideerd met betrekking tot hun kwaliteit, veiligheid en werkzaamheid voor toelating op de markt. Tot op heden, dierproeven zijn de standaard methode voor drug het testen en valideren. Vanwege soortspecifieke verschillen dierproeven vaak niet volledig het effect van de verbindingen bij mensen 1 evalueren. Daarom is het belangrijk menselijk weefsel modellen die kunnen worden gebruikt voor in vitro testen van nieuwe geneesmiddelen en stoffen te verkrijgen.
Een van de speerpunten van onze groep is het creëren van in vitro testmodellen met onze biologische gevasculariseerde steiger (BioVaSc) 2,3. De BioVaSc kan worden gebruikt als een statische of dynamische 3D matrixsysteem. Voor statische cultuur, wordt de gedecellulariseerde varkens jejunal segment (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc) geplaatst in een metalen inzetstuk voor cel opnieuw plannen. Verschillende cellen, zoals kanker en endotheliale cellen kunnen worden gekweekt op het schavot.
<pclass = "jove_content"> Voor dynamische cultuur, wordt de BioVaSc een bioreactorsysteem die stroom geldt voor de gehele vaatstelsel of over het oppervlak van de steiger bevestigd. Voor bioreactoren voeren biologische, mechanische of elektrische stimuli die inwerken op de differentiatie of proliferatie van cellen 4. Voor bioreactoren op het gebied van weefselengineering het basisconcept is het simuleren van de omstandigheden in het menselijk lichaam. Waarin worden cellen voorzien natuurlijke omgeving waarin ze kunnen communiceren met elkaar en de omliggende extracellulaire matrix. Voor de productie van in vitro testsystemen of transplantaties, de mogelijkheid om de natuurlijke omgeving van cellen nabootsen met een geschikte draagstructuur en bioreactorsysteem kritisch 5. Daarom moeten complexer en technisch veeleisende apparaten ontwikkeld om deze taken te vervullen 6.Het is verder mogelijk om onze steiger gebruiken voor de opriishment van een gevasculariseerde model vanwege de bewaarde buisvormige structuren, die het voederen slagader, ader, en het verbinden van capillaire bed te nemen. Alle varkens cellen moeten worden verwijderd door chemische, mechanische en enzymatische ontcelling en de steiger-gamma-gesteriliseerd. De herstelde buisvormige vasculaire structuren kunnen vervolgens worden ingezaaid met menselijke microvasculaire endotheelcellen met een recirculatiesysteem perfusie bioreactor 7, waarbij de biomechanische en / of biochemische parameters zoals pH, temperatuur, druk, nutriënt en afvalverwijdering 6 nabootst. De re-endothelialisatie van de buisvormige structuren creëert een menselijke equivalent bloedvat in de collagene steiger 3,7. In de volgende stap, kan het oppervlak van de voormalige lumen (mucosa) worden geënt met primaire humane cellen co-kweken 3,7,8 stellen.
In deze studie een 3D tumor testsysteem is opgezet door co-kweken van een tumor cellijn met primaire stromal cellen onder statische en dynamische omstandigheden op de SIS-Muc.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bij vergelijking van 2D en 3D kweeksystemen in tumoronderzoek, 3D systemen, ondanks de duurdere benadering hebben bewezen de omstandigheden biologische micromilieu beter nabootsen. Het kan worden aangetoond dat sommige tumorcellen groeien in een 3D kweek veel trager dan in een gewone 2D cultuur 12, die in overeenstemming met de situatie in een echte tumor. Bissell en medewerkers toonden in hun werk dat het gedrag van kankerverwekkende borstcellen geeft de in vivo situatie, waaronder celmorfologie en signalering, nauwkeuriger wanneer een 3D-kweek in een matrix biedt cel-ECM interacties. Bovendien benadrukte ze het belang van de extracellulaire omgeving in 3D door aan te tonen dat veranderingen in het milieu interacties leidde tot de terugkeer van de kwaadaardige cellen een normaal fenotype. Daarnaast en vooral, deze resultaten kunnen ook worden bevestigd in in vivo diermodellen 10,11.
NHOUD "> De directe vergelijking van in vivo dierproeven en in vitro weefselmodellen openbaart en nadelen van beide systemen. Een voordeel van in vitro modellen toestemming van een veel betere real-time of vaste beeldvormend microscopie. Een beperking is dat ze nabootsen statische of korte termijn omstandigheden, terwijl in vivo systemen vaak vooruitgang. Het huidige gebrek aan vaatstelsel en normale transport van kleine moleculen, gastheer immuunreacties en andere cel-cel interacties zijn verdere nadelen van in vitro modellen 12. Daarom 3D in vitro systemen zoals gepresenteerd in deze studie bieden een veelbelovende aanvulling op dierproeven. Zij bieden een betere vergelijkbaarheid voor het menselijk organisme en dus het minimaliseren van experimentele misinterpretaties. Biomimetic in vivo modelsystemen zullen dus meer relevant om te bestuderen hoe kanker en metastatische verspreiding afhankelijk is geworden op microenvironmental voorwaarden die tumorig regulerenenesis 11.Onze studie toont aan dat de 3D-omgeving die de SIS-Muc leidt tot een tumor-achtig weefsel vorming van cellen, die niet wordt waargenomen in de gemeenschappelijke 2D celkweek (zie figuur 3A). Bovendien is het gebruik van primaire cellen afkomstig van tumor biopsies is een zeer belangrijke stap in de richting van gepersonaliseerde geneeskunde, een discipline die zich richt op het identificeren van de beste behandeling, afhankelijk van de individuele behoeften van een patiënt. Integratie van primaire patiënt-specifieke tumorcellen geïsoleerd uit biopsie materiaal zal in vitro testen van therapeutische strategieën. Deze testsystemen maakt het mogelijk om verschillende geneesmiddelen en combinaties daarvan te onderzoeken in een tijd-en kostenbesparende high-throughput screening. Bovendien is de integratie van tumor geassocieerde bindweefselcellen zoals in deze studie is belangrijk voor de individuele benadering, aangezien micro invloeden een tumor tumorprogressie 13 en kunnen blijken als suitable therapeutisch doel.
Als alternatief voor een persoonlijke benadering, kunnen onze tumormodel worden gemodificeerd om te dienen als een algemeen tumor testsysteem door vermenging met gevestigde tumorigene cellijnen. Dit is een veelbelovende aanpassing voor fundamenteel onderzoek. Voor beide dopingcontrole zal de aanwezigheid van een vasculaire structuur vereist om de verspreiding en toepassing van therapeutische substanties getest. De SIS-Muc matrix kan de basolaterale zaaien met primaire MVEC voor barrière opname studies, zal het opnieuw plannen van de bewaarde vasculaire structuren van de BioVaSc verdere verbetering van de studie van de drug delivery.
Om weefselmodellen maken, kan een 3D biologisch afbreekbare matrix gebruikt als raamwerk voor een co-kweek van verschillende celtypen 14. Het gebruik van dergelijke 3D matrices wordt vaak beperkt door het ontbreken van een functioneel vascularisatie. Dit probleem kan worden opgelost door het gebruik van de BioVaSc, die bewaard bloedvat Str biedtuctures, die kan worden ingezaaid met endotheelcellen. Voorts voorziet de BioVaSc extracellulaire componenten die de hechting van de cellen te waarborgen en weefseldifferentiatie vergemakkelijken. Het maakt het ook de lange-termijn weefsel specifieke functie van bioartificial 3D weefsels 7,8,15. De voorwaarde voor de engineering van functionele vasculaire substituten is het nabootsen van menselijke fysiologische en biomechanische voorwaarden. Daarom bioreactor systemen, die aan deze eisen kunnen implementeren in vitro, zijn van extreem belang voor het creëren van biologische tumor modellen.
De combinatie van de BioVaSc de bioreactor technologie en co-kweken van verschillende celtypen is een veelbelovende methode om gevasculariseerde tumor weefsels, die de studie van mechanismen die relevant zijn voor de progressie van kanker, zoals angiogenese en metastase zal genereren. We zien zoals tumor modellen als een veelbelovende aanpak ter aanvulling dierproeven door middel van een gelijkwaardigede humane tumor fysiologie.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Jan Hansmann (Fraunhofer IGB, Stuttgart) bedanken voor zijn technische ondersteuning aan bioreactoren en de bioreactor incubator ontwikkelen.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Collagenase solution | SERVA | 17454 | (500 U/ml) |
| Dispase solution | Gibco | 17105-041 | (2.0 U/ml) |
| DMEM, high-glucose | PAA | G0001,3010 | |
| DNase | ROCHE | 10104159001 | 200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep |
| DZ solution | Roth | 3484.2 | 34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water |
| FCS | LONZA | DE14-801F | |
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| medical pressure transducer | MEMSCAP | SP844 | |
| monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor | DAKO Cytomation | M0616 | Clone F8/86 0.12 μg/ml |
| mouse monoclonal anti-human p53 | DAKO Cytomation | IS616 | Clone DO-7 ready-to-use |
| peristaltic pump | Ismatec | ||
| sterile disposable dome | MEMSCAP | 844-28 | |
| Trypsin / EDTA solution | PAA | L11-003 | 0,05% |
| VascuLife (VEGF-Mv) | Lifeline | LL-0003 | |
| Versene | Gibco | 15040-033 |
References
- Schenke-Layland, K., Nerem, R. M. In vitro human tissue models–moving towards personalized regenerative medicine. Adv. Drug Deliv. Rev. 63, 195-196 (2011).
- Pusch, J., Votteler, M., et al. The physiological performance of a three-dimensional model that mimics the microenvironment of the small intestine. Biomaterials. 32, 7469-7478 (2011).
- Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research. J. Biotechnol. 148, 56-63 (2010).
- Lanza, R., Langer, R., Vacanti, J. . Principles of tissue engineering. , (2007).
- Barron, V., Lyons, E., Stenson-Cox, C., McHugh, P. E., Pandit, A. Bioreactors for cardiovascular cell and tissue growth: a review. Ann. Biomed. Eng. 31, 1017-1030 (2003).
- Martin, I., Wendt, D., Heberer, M. The role of bioreactors in tissue engineering. Trends Biotechnol. 22, 80-86 (2004).
- Mertsching, H., Walles, T., Hofmann, M., Schanz, J., Knapp, W. H. Engineering of a vascularized scaffold for artificial tissue and organ generation. Biomaterials. 26, 6610-6617 (2005).
- Linke, K., Schanz, J., Hansmann, J., Walles, T., Brunner, H., Mertsching, H. Engineered liver-like tissue on a capillarized matrix for applied research. Tissue Eng. 13, 2699-2707 (2007).
- Holtkamp, N., Atallah, I., et al. MMP-13 and p53 in the progression of malignant peripheral nerve sheath tumors. Neoplasia. 9, 671-677 (2007).
- Weaver, V. M., Petersen, O. W., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Hutmacher, D. W., Horch, R. E., et al. Translating tissue engineering technology platforms into cancer research. J. Cell. Mol. Med. 13, 1417-1427 (2009).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Yang, S. -. T., Zhang, X., Wen, Y. Microbioreactors for high-throughput cytotoxicity assays. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 11, 111-127 (2008).
- Schultheiss, D., Gabouev, A. I., et al. Biological vascularized matrix for bladder tissue engineering: matrix preparation, reseeding technique and short-term implantation in a porcine model. J. Urol. 173, 276-280 (2005).
