La barra estabilizadora: Administración de Alcohol para moscas
Summary
Drosophila ha surgido como un sistema modelo significativo para la disección de las bases celulares y moleculares de las respuestas de comportamiento al alcohol. Aquí se presenta un protocolo para la recogida de datos de sensibilidad de alcohol en un contexto circadiano que se puede aplicar fácilmente a otros experimentos y es muy adecuado para la investigación de pregrado.
Abstract
Moscas de la fruta (Drosophila melanogaster) son un modelo establecido para la investigación del alcohol y de la biología circadiana. Recientemente, se demostró que el reloj circadiano modula la sensibilidad al alcohol, pero no la formación de la tolerancia. Aquí se describe el protocolo en detalle. El alcohol se administró a las moscas usando la barra estabilizadora. En esta configuración, el vapor de alcohol saturado que se mezcla con aire humidificado en proporciones fijas, y se administró a las moscas en cuatro tubos de forma simultánea. Las moscas se crían en condiciones estandarizadas con el fin de minimizar la variación entre las repeticiones. Tres días de edad moscas de diferentes genotipos o tratamientos se utilizan para los experimentos, de preferencia, haciendo coincidir las moscas de dos puntos diferentes de tiempo (por ejemplo, CT 5 y CT 17) hacer comparaciones directas posible. Durante el experimento, las moscas están expuestos durante 1 hora con el porcentaje predeterminado de vapor de alcohol y el número de moscas que exhiben la pérdida del reflejo de enderezamiento (Lorr) o sedción se contabilizan cada 5 min. Los datos se pueden analizar usando tres enfoques estadísticos diferentes. La primera consiste en determinar el momento en el que el 50% de las moscas han perdido su reflejo de enderezamiento y utilizar un análisis de la varianza (ANOVA) para determinar si existen diferencias significativas entre los momentos. La segunda es determinar las moscas porcentuales que muestran Lorr después de un número especificado de minutos, seguido de un análisis de ANOVA. El último método es el de analizar la serie entera veces utilizando estadística multivariante. El protocolo también se puede utilizar para experimentos no circadianos o comparaciones entre los genotipos.
Introduction
Drosophila melanogaster demuestran las respuestas conductuales bifásicos al alcohol 1 que son análogas a las respuestas humanas a este fármaco 2,3. Tras la exposición inicial a bajas concentraciones de alcohol, moscas exhiben mayor actividad locomotriz, sustituida por una falta de coordinación motora, la pérdida del control postural y corregir reflejos (pérdida del reflejo: Lorr) y sedación (falta completa de la actividad motora en respuesta a la estimulación mecánica) como la exposición al alcohol progresa 4-9. El reloj circadiano endógeno es un fuerte modulador de la sensibilidad al alcohol y la toxicidad como se ha observado en ratones, ratas 10,11 12, y los seres humanos 13. Los recientes avances en la investigación de Drosophila han demostrado que el reloj circadiano modula la sensibilidad de alcohol aguda, pero no alcohol tolerancia 1. Los poderosos enfoques genéticos disponibles en Drosophila mutantes a través de estudios y manipulaciones transgénicas de espacialy temporal de la expresión génica proporciona un sistema que permite un rápido avance en la identificación de los mecanismos celulares y moleculares subyacentes a los comportamientos complejos. El uso de Drosophila como herramienta de investigación ha permitido avances sustanciales en la comprensión de la neurobiología del alcohol que se pueden traducir rápidamente a los mamíferos 14-16. Con el fin de facilitar la comprensión de los mecanismos moleculares a través de la que el reloj circadiano modula la sensibilidad al alcohol y para medir de manera uniforme las respuestas de comportamiento a través de puntos de tiempo circadianos, un protocolo de administración de alcohol adecuada para su uso en condiciones de luz roja tenue se requiere. Para Drosophila, el alcohol puede ser administrado a través de la suplementación de alimentos para la exposición crónica o de forma fiable a través de la administración de alcohol en forma de vapor para las exposiciones agudas. Aquí se describe un protocolo de administración de alcohol adecuado para la evaluación de la modulación circadiana de la pérdida de los reflejos de recuperación (Lorr) 1, así comosedación.
Las moscas son arrastradas con 12 hr: 12 hr LD ciclos a temperatura constante y luego transferidos a un régimen de luz controlada durante 2-5 días, dependiendo de la pregunta experimental. Las moscas se expusieron a vapor de etanol en un dispositivo conocido como la barra estabilizadora. En este dispositivo, cantidades controladas de aire se burbujeado a través de agua y alcohol; los vapores se mezclan entonces y se dirigen en una carcasa vial de las moscas. Cada 5 minutos, las moscas se califican para el número que no puede mostrar corregir reflejos o se han convertido en sedado. LORR porcentajes para cada punto de tiempo se calculan y se comparan entre puntos de tiempo circadianos o entre cepas de moscas. La simplicidad y la confiabilidad de la entrega de alcohol mediante el suministro de alcohol Flybar combinado con opciones de análisis de comportamiento proporciona un beneficio significativo para los experimentos circadianos realizados en condiciones oscuras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los costos del abuso de alcohol y alcoholismo para la sociedad es enorme, tanto en términos de costos humanos y económicos 29 30,31. Drosophila como modelo ofrece un sistema rápido y versátil de examinar rápidamente las respuestas de comportamiento de un gran número de personas y, como tal, se ha utilizado ampliamente para tanto el alcohol 5,7,32-34 y la investigación circadiano 35-37.
Aquí, describimos un protocolo sencillo para la administr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El financiamiento para esta investigación fue proporcionado por el Programa de Premio de Neurociencia de la Universidad de Florida State College de Medicina y el apoyo del Departamento de Ciencias Biológicas de la FSU. Financiación adicional fue proporcionado por una subvención-en-Ayudas del Fondo de Investigación del Alcohol Beverage Fabricante.
Materials
| Alcohol 190 proof | Various | ||
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
| Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
| 120° Y Connector | VWR | 82017-256 | |
| Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
| Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
| Miniature Air Regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
| Miniature Air Regulator Mounting Bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
| Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
| Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
| Vial | VWR | 89092-722 | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
| 5 mm Pyrex Glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper. |
| Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
| Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
| Very fine nylon netting | VWR | Various | |
| 15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
| Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
| Mini Flashlights with red filters | Mag-light |
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