Eine einfache und effiziente Methode, um Nuclear Factor Aktivierung in menschlichen Neutrophilen Erkennen von Durchflusszytometrie
Summary
Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten im Blut. Neutrophile besitzen transkriptionell reguliert Funktionen wie Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen und Hemmung der Apoptose. Diese Funktionen können mit dem hier vorgestellten Verfahren, die Detektion und Quantifizierung von nuklearen Faktoren können mittels Durchflusszytometrie in isolierten Zellkernen untersucht werden
Abstract
Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten im peripheren Blut. Diese Zellen sind die ersten, an den Standorten der Entzündung und Infektion auftreten und somit als erste Verteidigungslinie gegen eindringende Mikroorganismen. Neutrophile besitzen wichtige Funktionen wie antimikrobielle Phagozytose, Freisetzung von lytische Enzyme, und die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies. Zusätzlich zu diesen wichtigen Abwehrmechanismus funktioniert, führen Neutrophilen andere Aufgaben in Reaktion auf eine Infektion wie die Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen und Hemmung der Apoptose. Zytokine rekrutieren andere Leukozyten, die klar die Infektion zu helfen, und die Hemmung der Apoptose ermöglicht die Neutrophilen, länger zu leben am Ort der Infektion. Diese Funktionen werden auf der Ebene der Transkription reguliert. Da jedoch Neutrophilen kurzlebigen Zellen sind, kann die Untersuchung von transkriptionell reguliert Reaktionen in diesen Zellen nicht mit herkömmlichen Reportergen Verfahren durchgeführt werden, da es keine effiziente sindziente Techniken für neutrophilen Transfektion. Hier stellen wir eine einfache und effiziente Methode, die Detektion und Quantifizierung von nuklearen Faktoren isoliert und immunmarkierten Kerne mittels Durchflusszytometrie erlaubt. Wir beschreiben Methoden zur reinen Neutrophilen aus humanen peripheren Blut zu isolieren, diese Zellen zu stimulieren mit anti-Rezeptor-Antikörpern, zu isolieren und immunolabel Kerne und analysieren Kerne durch Durchflusszytometrie. Die Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um NF-kappaB und Elk-1 Kernfaktoren in Kernen von Neutrophilen und anderen Zelltypen erkennen. Somit stellt diese Methode eine Option zum Analysieren Aktivierung von Transkriptionsfaktoren an isolierten Kernen aus einer Vielzahl von Zelltypen.
Introduction
Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten im peripheren Blut ein. Während Entzündungen und Infektionen Neutrophile sind die ersten Zellen, die an der betroffenen Stelle erscheinen, wo sie als erste Verteidigungslinie 2 handeln. Neutrophile besitzen mehrere antimikrobielle Mechanismen 3 einschließlich Phagozytose, die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, die Freisetzung von lytischen Enzymen durch Degranulation und Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen 4,5. Neutrophile sind kurzlebige Zellen, die sich schnell durch Signalisierung von verschiedenen Rezeptoren auf der Zelloberfläche werden aktiviert. Obwohl Neutrophilen wurden berücksichtigt terminalen Zellen aufgrund ihrer kurzen Lebensdauer und weil sie Apoptose, wenn während des entzündlichen Prozesses 6 aktiviert unterziehen, ist es nun klar, dass sie auch ändern ihren Phänotyp, indem Sie die Ebene der Transkription bestimmter Gene. Die Produktion von Cytokinen 5 und der Hemmung der Apoptose 7,8 sind zwei iW ichtig aktivierungsabhängige Zellfunktionen auf der Ebene der Transkription in Neutrophilen reguliert. Nuclear factor kappaB (NF-kB) beteiligt sich an der transkriptionalen Kontrolle Zytokinproduktion 4 und bei der Regulation der Apoptose und Überleben der Zellen 9-11 in verschiedenen Zelltypen.
Die Signalwege, die nuclear factor-Aktivierung führen, sind in der Regel durch Reportergen-Assays oder durch elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays (EMSA) untersucht. Da jedoch Neutrophilen kurzlebigen Zellen sind, kann die Untersuchung von transkriptionell reguliert Reaktionen in diesen Zellen nicht mit Reportergen-Assays durchgeführt werden, da es keine effiziente Methoden zur Transfektion sind Neutrophilen. EMSA-Assays wurden in Neutrophilen verwendet worden, um nuclear factor-Aktivierung 12,13 erkunden, allerdings ist diese Methode aufwendig und teuer, da es die Verwendung von radioaktivem Material beinhaltet. Nukleofektion ist eine weitere Technik, die verwendet wurde successfully zu transfizieren Monozyten 14. Somit zumindest theoretisch könnte Kernfaktor Aktivierung der neutrophilen Granulozyten durch Transfektion detektiert werden (trotz niedriger Effizienz). Jedoch würde diese Technik teurer sein, zeitaufwendig und wahrscheinlich weniger quantitativ. Mikroskopische Analyse immunogefärbten Zellen könnten auch verwendet werden, um atomaren Faktoren im Kern zu erfassen. Tatsächlich haben wir NF-KB-Translokation in den Zellkern 15 auf diese Weise detektiert. Leider ist diese Technik auch zeitaufwendig, weniger quantitative und vorbehaltlich des Betrachters Bias.
Hier stellen wir eine einfache und effiziente Methode, die Detektion und Quantifizierung von nuklearen Faktoren isoliert und immunmarkierten Kerne mittels Durchflusszytometrie erlaubt. Wir beschreiben Techniken an Neutrophile aus humanen peripheren Blut zu isolieren, diese Zellen zu stimulieren über Integrine oder Fc-Rezeptoren mit anti-Rezeptor-Antikörpern, zu isolieren und immunolabel Kerne und analysieren Kerne durch Durchflusszytometrie (FBBILDUNG 1). Die Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um NF-kappaB 15 und Elk-1 16 Kernfaktoren in neutrophilen Kerne zu erkennen. Die Empfindlichkeit dieses Verfahren ermöglicht den Nachweis von kleinen Änderungen in nuclear factor Ebenen im Zellkern. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um das Niveau von Transkriptionsfaktoren in Kernen von anderen Zellarten zu analysieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Reinigung hier beschriebene Methode ermöglicht die Isolierung von unstimulierten Neutrophilen (PMN) mit einer Reinheit größer als 95% (bestimmt durch mikroskopische Beobachtung), in einer kurzen Zeit. Manchmal kann durch Neutrophile Erythrozyten kontaminiert werden, wenn letztere nicht vollständig lysiert werden. Dies bedeutet in der Regel nicht auf die Technik, da Erythrozyten und PMN kann leicht als deutliche Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie unterschieden werden. Isoliert PMN kann dann durch Verne…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Nancy Mora für ihre technische Unterstützung danken.
Diese Arbeit wurde durch Forschungsgelder 48.573-M und 168098 vom Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, Mexiko und durch Zuschüsse IN212308 und IN205311-2 von Dirección General de Asuntos del Personal Academico, Universidad Nacional Autonoma de Mexico, Mexico finanziert.
Materials
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab’)2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur |
References
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