Aislamiento de los precursores de células B subconjuntos de Sangre del Cordón Umbilical

1. Aislamiento de células mononucleares de sangre de cordón umbilical Preparar el tampón PBS-EDTA-añadir 5 ml de albúmina de suero bovino (BSA) solución madre a 95 ml de tampón de lavado (1:20 dilución). Desgasificar el tampón y mantener el búfer en hielo IMPORTANTE:. Si no se desgasificar el tampón puede resultar en resultados menos que óptimos cuando se aísla CD19 + células B porque las burbujas puede bloquear la columna de aislamiento. Preparar tubos cónicos de 50 ml por centrifugación en gradiente de densidad. Determinar el número de tubos necesarios para el procesamiento de la sangre del cordón umbilical (1 tubo puede procesar 8 ml de sangre) y añadir 15 ml de Ficoll-Paque PLUS a cada tubo. Diluir 8 ml de sangre de cordón con 24 ml de DPBS (1x) y cuidadosamente la capa de la mezcla diluida de sangre de cordón en la parte superior de la Ficoll-Paque PLUS en cada uno de los tubos de 50 ml cónicos. No mezcle la sangre y Ficoll-Paque PLUS IMPORTANTE:. Para evitar la mezcla de la sangre del cordón umbilical y PLUS Ficoll-Paque, sostenga el tubo en un ángulo de 45 grados ycapa de la mezcla de sangre lentamente. Centrifugar a 400 xg durante 40 min a 20 ° C. Las células mononucleares (MNC) se mantendrá en el plasma-Ficoll-Paque PLUS interfaz mientras que los granulocitos y eritrocitos de sedimentos debido a la mayor densidad a la presión osmótica de Ficoll-Paque PLUS. Etiqueta siete 5 ml de fondo redondo tubos para ser utilizados en la Parte 3 con el ID de la muestra, la fecha y la siguiente: Tubo Etiqueta Propósito 1 Sin teñir Células no teñidas para la normalización durante la citometría de flujo 2 7AAD Para determinar la viabilidad durante citometría de flujo 3 + + + Contiene las células que se según 4 34 + Para recoger CD34 + / CD19 +(Fines de pro-B – principios de pre-BI), las células 5 Bajo 45 Para recoger CD34 – / CD19 + / CD45 bajo (pre-BI), las células 6 45 med Para recoger CD34 – / CD19 + / CD45 Med (pre-BII) las células 7 45 de alto Para recoger CD34 – / CD19 + / CD45 alto (B) células inmaduras Escudo tubos 4, 5, 6, y 7 con FBS al 2% y colocar todos los tubos en hielo. Aspirar la capa superior de plasma cuidadosamente y evitar el contacto con la capa de células mononucleares. Usando una pipeta de 10 ml de vidrio, transferir cuidadosamente la capa de células mononucleares a un nuevo tubo cónico de 50 ml. Combinar las células mononucleares de tres tubos juntos en un tubo de 50 ml único. Llenar el tubo con PBS, mezclar suavemente y centrifugar a 300 xg durante 10 min a20 ° C. Aspirar con cuidado el sobrenadante sin alterar el sedimento celular. Repita 1x. Después del primer lavado, resuspender los gránulos y transferir a un tubo de 50 ml único cónica. Suavemente resuspender el sedimento celular en 200 ul de PBS. Eliminar 1 l de la suspensión de células, añadir a 1 ml de PBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y dejar de lado para contar (contar las células después de la colocación de la suspensión 50 ml de células en la centrífuga). Llenar el tubo con PBS y centrifugar a 200 xg durante 15 min para eliminar las plaquetas. Eliminar el sobrenadante completamente sin alterar el sedimento celular. 2. Modificado células B Aislamiento de células mononucleares utilizando separación MACS Resuspender el precipitado de la etapa 160 con 1,7 l frío (4 ° C) con EDTA tampón PBS. Añadir 40 l B-CLL cóctel de anticuerpos con biotina. Pipeta para mezclar bien e incubar durante 10 min a 4 ° C. Lavar las células – añade 1 ml frío (4 ° C) con EDTA tampón PBS por 10 millones de células (células numbre determinado en el paso 1,7) y se centrifuga a 300 xg durante 10 min. Aspirar el sobrenadante completamente y luego volver a suspender el sedimento celular en 320 l frío (4 ° C) con EDTA tampón PBS. Añadir 80 mu l anti-biotina MicroBeads, se mezcla bien y se incuba durante 15 min a 4 ° C. Lavar las células – añadir 1 ml frío (4 ° C) con EDTA tampón PBS por 10 millones de células y se centrifugan a 300 xg durante 10 min. Resuspender hasta 100 millones de células en 500 l de frío (4 º C) con EDTA tampón PBS. Volumen de tampón de escala de acuerdo con el número de células. Preparar columnas MACS y separadores MACS durante la centrifugación (Paso 2.5). Colocar una columna de LS en el campo magnético del separador MACS, añadir 3 ml de frío (4 º C) con EDTA tampón PBS en la columna y permitir que el tampón a gotear a través de la columna. Use un receptáculo para coger el flujo a través. Desechar el flujo a través. Colocar un tubo cónico de 50 ml debajo de la columna y pipetear la suspensión celular en la columna. Permita que las células no marcadas a gotear through de la columna y en el tubo cónico de 50 ml. IMPORTANTE: Estas son las células que se utilizarán para el etiquetado de anticuerpos y de células de clasificación. No deseche el flujo a través. Para recuperar todas las células de la etapa 2,5, agregar un adicional de 1 ml de frío (4 º C) con EDTA tampón PBS a las paredes del tubo cónico. Mezclar suavemente y pipetear la suspensión celular restante en la columna. Repita 1x. Continúe en el paso 2,8 usando las células no marcadas recogidos en el tubo cónico después de pasar a través de la columna. Llenar el tubo cónico que contenía las células no marcadas con PBS y centrifugar a 300 xg durante 10 min. Retirar con cuidado el sobrenadante sin alterar el sedimento celular. Añadir 200 l de EDTA-tampón PBS y suavemente resuspender las células. 3. Anticuerpo etiquetado y preparación para la clasificación de células Aspirar 1 l de la suspensión celular y el lugar en el tubo con la etiqueta "sin mancha" (paso 1,4). Añadir 500 l de EDTA tampón PBS y almacenar el tubo en hielo. Añadir 20l de cada anticuerpo (CD19, CD34 y CD45) por millón de células en la suspensión celular restante. Mezclar bien y colocar el tubo en la oscuridad durante 30 min a TA. Anticuerpos CD son ligeros pasos delicados, completos 2-4 con las luces apagadas. Después de 30 min de incubación con anticuerpos, aspire 40 l de la suspensión celular y colocarlo en el tubo etiquetado "7AAD". Añadir 1 ml de PBS en el tubo y centrifugar a 500 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 100 l de tampón de unión. Añadir 7 l de 7AAD (7-Aminoactinomycin D) e incubar en la oscuridad durante 10 min a TA. Durante la etapa de 10 min de incubación completa 3,4. Añadir PBS a la parte superior del tubo que contiene las células que quedan marcadas con anticuerpos CD. Centrifugar el tubo a 500 xg durante 3 min. Eliminar el sobrenadante, añadir 500 l de EDTA tampón PBS y resuspender el botón celular. Transferir todo el volumen de la suspensión de células en el tubo etiquetado "+ + +". Para recuperar la totalidad de la suspensión de células add un adicional de 1 ml de EDTA tampón PBS al tubo cónico de 50 ml y la transferencia en el tubo marcado como "+ + +". Después de la incubación (paso 3.3), añadir 300 l de tampón de unión en el tubo 7AAD. El "sin mancha", "7AAD" y "+ + +" muestras y el "34 +", "45 bajo", "med 45" y "45" tubos altos están listos para citometría de flujo. 4. Clasificación de células Utilizando el citómetro de flujo MoFlo XDP Set-up MoFlo para la clasificación: Alineación láser, chorro de gotitas estabilizar, determinar retraso gota. Preparar los controles individuales de compensación de color utilizando Invitrogen AbC ratón talón kit (o similar) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ejecutar los controles de un solo color, ajustando las tensiones de canales de fluorescencia para la separación óptima de las poblaciones positivas y negativas. Establecer y aplicar los coeficientes de compensación parámetro compensa con el protocolo de recogida. Volver a establecer coeficientes de compensación cada vez que se obtiene un nuevo lote de anticuerpos. Crear protocolo incluyendo parcelas como se muestra en la Figura 2. Ejecutar muestra sin teñir, ajuste de voltaje y ganancia de dispersión frontal y lateral, e identificar las poblaciones negativas de fluorescencia. Debido a que la recuperación de ADN es el objetivo de la clase, el umbral debe establecerse bajo (≤ 1%), de modo que el ADN que contiene desechos no contamine las muestras recuperadas. * Asegúrese de que el sistema de evacuación de aerosol se está ejecutando en todo momento que viven las células humanas se están ejecutando en el MoFlo. Ejecutar una pequeña alícuota de los + + + muestra (~ 50.000 eventos) para establecer la estrategia de puerta (Figura 2). Debido a que las células B progenitoras no dispersar de forma idéntica a las células B maduras, sin sincronización backgate el CD19 + / CD34 + población en el complot vs SSC FSC para asegurar la puerta de linfocitos incluye posibles células pro-B. De esta muestra también se establece la población fluorescencia negativa para 7AAD. Ejecutar el ejemplo 7AAD para determinar la viabilidad de la muestra. Sólo las células de ordenación a partir de una muestra con alta viabilidad en laprincipio (≥ 95%) como células muertas se tiñen de manera indiscriminada y puede contaminar las poblaciones de ordenación. Configure las decisiones de ordenación para recoger cuatro poblaciones: CD19 + / CD34 +, CD19 + / CD34 – / CD45 baja; CD19 + / CD34 – / CD45 med, y CD19 + / CD34 – / CD45 alto. Incluya los linfocitos y las puertas doblete discriminación en las decisiones de ordenación de todas las poblaciones. Para evitar obstrucciones en la punta de la clasificación, el filtro + + + muestra a través de un filtro de 40 micras celda inmediatamente antes de la selección y volver a filtrar si cualquier agregación se produce en la muestra durante la clase. Ordenar las células en tubos de recogida (paso 1,4) recubiertas con FBS al 2% en PBS en un soporte de tubo enfriada o hielo compactadas. Inmediatamente después de la especie se ha completado, extraer el ADN.