Isolatie van Precursor B-cel subsets van navelstrengbloed

1. Isolatie van mononucleaire cellen uit navelstrengbloed Bereid PBS-EDTA 5 ml bovine serum albumine (BSA) stockoplossing aan 95 ml spoelbuffer (1:20 verdunning) buffer-voegen. Degas de buffer en bewaar de buffer op het ijs. BELANGRIJK: Het niet ontgas de buffer kan leiden tot minder dan optimale resultaten bij het ​​isoleren van CD19 + B-cellen, omdat bellen kan de isolatie kolom blokkeren. Bereid 50 ml conische buizen voor dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Bepaal het aantal buizen die nodig zijn voor het verwerken van het navelstrengbloed (1 tube kan 8 ml bloed te verwerken) en voeg 15 ml van Ficoll-Paque PLUS aan elke buis. Verdun 8 ml van navelstrengbloed met 24 ml DPBS (1X) en voorzichtig het verdunde laag navelstrengbloed mengsel op de Ficoll-Paque PLUS in elk van de 50 ml conische buizen. Niet mengen het bloed en Ficoll-Paque PLUS. BELANGRIJK: Om te voorkomen dat het mengen van het navelstrengbloed en Ficoll-Paque PLUS, houdt u de buis in een hoek van 45 graden enlayer het bloed mengsel langzaam. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 40 min bij 20 ° C. Mononucleaire cellen (MNC) blijft op de plasma-Ficoll-Paque PLUS-interface dat granulocyten en erytrocyten sediment door hogere dichtheid bij de osmotische druk van Ficoll-Paque PLUS. Label zeven 5 ml rondbodem buizen voor gebruik in deel 3 met het monster ID, datum en de volgende: Buis Label Doel 1 Onbevlekt Ongekleurde cellen voor normalisatie in flowcytometrie 2 7AAD Levensvatbaarheid te bepalen tijdens flowcytometrie 3 + + + Bevat de cellen die worden gesorteerd 4 34 + Om CD34 + / CD19 verzamelt +(Late pro-B – vroege pre-BI) cellen 5 45 lage / CD19 + / CD45 laag (pre-BI) cellen – aan CD34 te verzamelen 6 45 med / CD19 + / CD45 med (pre-BII) cellen – aan CD34 te verzamelen 7 45 hoog / CD19 + / CD45 hoog (onrijpe B) cellen – aan CD34 te verzamelen Coat buizen 4, 5, 6 en 7 met 2% FBS en plaats alle buizen op ijs. Zorgvuldig Zuig de bovenste plasma laag en vermijd contact met de mononucleaire cellaag. Met een 10 ml glazen pipet voorzichtig overdragen mononucleaire cellaag in nieuw 50 ml conische buis. Combineer de mononucleaire cellen uit drie buizen in een 50 ml buis. Vul de buis met PBS, en meng bij 300 xg gecentrifugeerd gedurende 10 min bij20 ° C. Zorgvuldig aspireren het supernatans zonder verstoring van de cel pellet. Herhaal 1x. Na de eerste wasbeurt, resuspendeer de pellets en overbrengen naar een 50 ml conische buis. Zachtjes resuspenderen de celpellet in 200 ul PBS. Verwijder 1 pi van de celsuspensie toe te voegen aan 1 ml PBS in een 1,5 ml microcentrifugebuis en gereserveerd voor het tellen (tellen cellen nadat het 50 ml celsuspensie in de centrifuge). Vul de buis met PBS en centrifugeer bij 200 xg gedurende 15 min aan bloedplaatjes verwijderen. Volledig verwijderen van de bovenstaande vloeistof zonder de celpellet. 2. Gewijzigd B-cel Isolatie van mononucleaire cellen met behulp van MACS Scheiding Resuspendeer de pellet uit stap 1.7 met 160 pi koude (4 ° C) EDTA-PBS buffer. Voeg 40 ul B-CLL biotine antilichaam cocktail. Pipetteer goed te mengen en gedurende 10 min incuberen bij 4 ° C. Was de cellen – voeg 1 ml koud (4 ° C) EDTA-PBS-buffer per 10 miljoen cellen (cel number bepaald in stap 1.7) en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten. Zuig het volledig supernatant en resuspendeer de celpellet in 320 pi koude (4 ° C) EDTA-PBS buffer. Voeg 80 ul anti-biotine microkorrels, goed mengen en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Was de cellen – voeg 1 ml koude (4 ° C) EDTA-buffer PBS per 10 miljoen cellen en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten. Resuspenderen tot 100 miljoen cellen in 500 pi koude (4 ° C) EDTA-PBS buffer. Scale buffervolume volgens het aantal cellen. Bereid MACS Kolommen en MACS Separators tijdens het centrifugeren (Stap 2.5). Plaats een LS kolom in het magnetische veld van de MACS separator, 3 ml koude (4 ° C) EDTA-PBS buffer op de kolom en laat de buffer te druppelen door de kolom. Gebruik een bakje om de stroom te vangen door. Gooi de doorstroming. Een 50 ml conische buis onder de kolom en pipetteer de celsuspensie op de kolom. Laat de niet-gelabelde cellen throug druppelenh de kolom en in de 50 ml conische buis. Belangrijk: Dit zijn de cellen die worden gebruikt voor antilichaam labeling en celsortering. Stel de stroom niet weg door. Om alle cellen van stap 2.5 herstellen, een extra 1 ml koude (4 ° C) EDTA-PBS buffer aan de wanden van de conische buis. Meng voorzichtig pipetteren en de resterende celsuspensie op de kolom. Herhaal 1x. Ga verder met stap 2.8 met de gelabelde cellen verzameld in de conische buis na het passeren door de kolom. Vul de conische buis met ongelabelde cellen met PBS en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatans zonder verstoring van de cel pellet. Voeg 200 ul EDTA-buffer PBS en voorzichtig resuspendeer de cellen. 3. Antilichaam Labeling en voorbereiding voor celsortering Verstuif 1 pi van de celsuspensie en plaats in de buis met het label "ongekleurd" (Stap 1.4). Voeg 500 ul EDTA-buffer PBS en slaan de buis op ijs. Voeg 20pi van elk antilichaam (CD19, CD34 en CD45) per miljoen cellen in de resterende celsuspensie. Meng goed en plaats de buis in het donker gedurende 30 minuten bij RT. CD antilichamen zijn lichtgevoelig, voert u stap 2-4 met de lichten uitgeschakeld. Na 30 min incubatie met antilichamen, zuig 40 pi van de celsuspensie en plaats het in de buis met het label "7AAD". Voeg 1 ml PBS in de buis en centrifugeer bij 500 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 100 ul bindingsbuffer. Voeg 7 pl 7AAD (7-Aminoactinomycin D) en incubeer in het donker gedurende 10 minuten bij RT. Tijdens de 10 minuten incubatie volledig stap 3.4. Voeg PBS naar de top van de buis met de overige cellen gelabeld met antistoffen CD. Centrifugeer het buisje bij 500 xg gedurende 3 minuten. Verwijder het supernatant, voeg 500 ul EDTA-buffer PBS en resuspendeer de celpellet. Breng het gehele volume van de celsuspensie in de buis met het label "+ + +". Als u alle van de celsuspensie een herstellendd extra 1 ml EDTA-buffer PBS om de 50 ml conische buis en overbrengen in de buis met het label "+ + +". Na incubatie (Stap 3.3), voeg 300 ul bindingsbuffer in 7AAD buis. De "ongekleurde", "7AAD" en "+ + +" samples en "34 +", "45 laag", "med 45" en "45 hoog" buizen klaar voor flowcytometrie. 4. Celsortering Met behulp van de MoFlo XDP Flow Cytometer Set-up MoFlo voor het sorteren: Lijn lasers; stabiliseren druppel stroom, het bepalen van daling vertraging. Bereid enkele kleur vergoeding controles met behulp van Invitrogen AbC Mouse kraal kit (of iets dergelijks) volgens de instructies van de fabrikant. Run single kleurinstellingen, het aanpassen van de spanningen van fluorescentie-kanalen voor een optimale scheiding van positieve en negatieve populaties. Stel compensatie coëfficiënten en van toepassing gecompenseerd parameter aan collectie protocol. Herstel compensatie coëfficiënten telkens een nieuwe partij antilichaam verkregen. Maak protocol waaronder plots zoals getoond in figuur 2. Run ongekleurde monster, zet spanning en winst voor voorwaartse en zijwaartse verstrooiing, en identificeren negatieve fluorescentie populaties. Omdat DNA-herstel is het doel van de soort, moet de drempel worden ingesteld laag (≤ 1%), zodat DNA-bevattende puin niet de herstelde monsters verontreinigen. * Zorg ervoor dat de Aerosol Evacuatie System draait te allen tijde die leven van menselijke cellen worden uitgevoerd op de MoFlo. Voer een kleine hoeveelheid van de + + + sample (~ 50.000 events) aan de gating strategie (figuur 2). Omdat B-cell progenitors niet scatter identiek aan B-cellen rijpen, backgate de ungated CD19 + / CD34 + populatie op de SSC versus FSC plot te zorgen voor de lymfocytpoort omvat potentiële pro-B-cellen. Van deze steekproef ook de negatieve fluorescentie bevolking voor 7AAD. Voer het 7AAD monster naar het levensvatbaarheid te bepalen. Enige soort cellen van een monster met een hoge levensvatbaarheid op deaanvang (≥ 95%) als dode cellen zullen zonder onderscheid vlekken en kan verontreinigen soort populaties. Stel soort beslissingen tot vier populaties te verzamelen: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 – / CD45 laag; CD19 + / CD34 – / CD45 med, en CD19 + / CD34 – / CD45 hoog. Neem de lymfocyt en doublet discriminatie poorten in de soort beslissingen van alle bevolkingsgroepen. Om klompen te voorkomen in de sorteer-tip, filter + + + monster door een 40 um cel zeef onmiddellijk voor het sorteren en opnieuw filtreer als er een aggregatie optreedt in steekproef tijdens het sorteren. Sorteren cellen in verzamelbuizen (Stap 1.4) bekleed met 2% FBS in PBS in een gekoelde of ijs vol buishouder. Onmiddellijk na sorteren is voltooid, extraheren DNA.