ケミカルバイオロジーのフリーラジカル：化学的挙動からバイオマーカー探索·開発へ

1。コレステリルエステルのモノ – トランス異性体の合成 2 – プロパノール中コレステリルエステル（リノール酸やアラキドン酸コレステリルエステル）（15 mM）を溶解する。良い可溶化のために、サンプルを、アルゴン下で15分間超音波処理した。 （7 mM濃度に到達するために、チオールの2 Mのストック溶液から）2 – プロパノール、2 – メルカプトエタノールを加え、石英光化学反応器に溶液を移します。溶液中の酸素の存在を排除するために、20分間アルゴンで反応混合物をフラッシュします。 22℃で5.5W低圧水銀ランプを用いて紫外線によって反応混合物を照射±2℃で4分間。証拠の分析のAg-TLC（銀薄層クロマトグラフィー）モノ-トランスコレステリルエステル（化学式については図1を参照）を形成することによってモニター。 TLCの染色はセリウムアンモニウムmolibdate（CAM）の溶液中でプレートを注ぐことによって行われ、スポット加熱に表示されているプレート。全収率の増加を求め、異性の他のラウンドを実行するために再利用することができる出発物質を、回復するために、早い段階で反応をクエンチ。 2 – プロパノール数mlで装置を洗浄し、丸底フラスコ内の反応混合液を収集します。溶媒を除去し、そして、文献に記載されたAg-TLCによるコレステリルエステルのモノ-トランス異性体を清める。5を使用して、モノ-トランスコレステリルリノール酸異性体の溶出液としてヘキサン-ジエチルエーテル（9:1 v / v）で、一方、使用ヘキサンモノトランスコレステリルアラキドン酸の異性体について – ジエチルエーテル – 酢酸（9:1:0,1 v / v）である。 2。ヒト血清からのコレステリルエステル画分の単離食塩水1mlでヒト血清（血液の遠心分離により得られたもの）1mlを希釈し、成果物（ 例えば酸化付加物）のを避けるために、アルゴン気流下、分液漏斗に溶液を注ぐ。 10ミリリットルのクロロホルム – メタノール（2を追加：1 v / v）の三度。アルブミンの存在に起因するエマルジョンの形成を制限するために、非常にゆっくりと分液漏斗を振ります。 食塩水（10ml）で一回有機層を洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウムで乾燥し、アルゴン気流下三角フラスコに集める。黄色油（血漿総脂質画分）を得ロータリーエバポレーターで揮発物を除去。 クロロホルム – メタノール1ml（2:1 v / v）を、アルゴン気流下取TLC上に負荷で原油を取り上げて、溶離剤としてヘキサン – ジエチルエーテル（9:1 v / v）の混合物を使用。コレステリルエステル画分を含有するシリカ部分を掻き、バイアルに注ぐ。その後、クロロホルム – メタノール（2:1 v / v）を用いて（3×5ml）でシリカを抽出した有機層を収集し、コレステリルエステル（通常〜1.5 mg）の純粋な画分を得て、蒸発させた後、溶媒を除去する。 -20℃でアルゴン·ストアの下にアルミ箔で覆われて暗いバイアル内コレステリルエステルを保つコレステリル電子stersは光や酸素に敏感である。 3。ラマン分光法によるモノトランスコレステリルエステルのキャラクタリゼーションセクション2で説明したように、ヒト血清（≥0.7 mg）をからコレステリルエステルを抽出し、四塩化炭素（≤10μL）とバイアル内の場所の少量で溶解する。そのラマン信号は、コレステリルエステル分析の関心領域と重なっていないので、 四塩化炭素を溶媒として選択されています。 使い捨てガラスピペットを介して試料ホルダーへの解決策を移し、その後慎重にアルゴンの遅い流れによって溶媒を除去する。均一な油性膜は試料ホルダの内壁に形成されると、測定のための測定器に後者を置く。 フーリエ変換は、コレステリルエステルのラマンスペクトルを直接任意の誘導体化反応することなく、脂質抽出で得られた形質転換された。試料上のレーザーパワーは、試料の損傷を避けるために<100 mWです。スキャンの合計数各スペクトルのバックグラウンドノイズを最小限に抑えることが≥800である。 それは分子中に存在するC = C二重結合（C = C伸縮モード）からの寄与を反映するので、ラマンスペクトルの1,700-1,630 cm -1の範囲が分析される。カーブフィッティング解析は、このようにします （ 図2を参照）シスおよびアルキル鎖脂肪酸やコレステロールのB環の二重結合でトランス二重結合から重畳貢献の区別を可能にする、この領域で実行されます。 正しく振動バンドに合わせて、いくつかのパラメータは固定または合理的な範囲内に拘束されるべきである。ハーフハイトの帯域幅は最高のコンピュータ最適化ルーチンによって決定されるのに対し、成分ピークプロファイルは、ローレンツとガウス関数の線形結合として記述されている。成分ピークの数と位置はまた、いくつかの弱い成分バンドを検出できるように第四次微分スペクトルを使用することによって得られる。以降の信号信号の分化時に劣化対雑音比13ポイントSavitsky-Golayの機能を持つ第四の誘導体を平滑化、第四誘導体の使用を排除することができ、有利である、したがって、対雑音比分解能と信号の間の適切な妥協点が得られた。最高のカーブフィッティングは、可能な限り低いC 2の値で得られる。 トランス異性体の存在は、1671年にコンポーネント±1脂肪酸鎖に起因する若干低い周波数に向かってシフトに加えて、cm -1で 、少なくとも、2つのコンポーネント、およびコレステロールC = C二重結合によって明らかにされています。血漿コレステリルエステルの代表的なラマンスペクトルを図9に示します。挿入図にコレステリルリノール酸とモノトランスコレステリルリノール酸異性体との特異的な領域の比較が示されています。 4。ガスクロマトグラフィーによる脂肪酸メチルエステル（FAME）と分析への誘導体化ディゾルブベンゼン – メタノール（2:3 v / v）を、アルゴン下アルミ箔で覆われて暗いバイアル内の所定の位置に水酸化ナトリウムの1M溶液0.5mlとコレステリルエステル（〜1.5 mg）を得た。 混合物は、溶離液としてヘキサン – ジエチルエーテル（9:1 v / v）の混合物を用いてTLCによる室温とモニターで撹拌したままにしておきます。反応時間は通常30分ですが、慎重な反応モニタリングが必要です。対応するメチルエステルが形成されると、実際には、反応が低下し、側副生成物の形成を避けるために、急冷する必要があります。 TLCは、メチルエステルの定量的な形成を示した。 食塩水1mlを添加することにより反応混合物をクエンチし、n-ヘキサン（3×2ml）でメチルエステルを抽出します。バイアルに有機層を回収した後、さらに精製せずにGC分析のために使用されているメチルエステル画分を、余裕を回転蒸発によって溶媒を除去する。 n-ヘキサンの最小量（通常は5分の1ミリグラムのメチルエステルを溶解0μL）と60メートル×0.25ミリメートル×0.25ミクロン（50％ – シアノプロピル） – メチルポリシロキサンカラムを装備したGCに注入します。以下のオーブンプログラムと水素炎イオン化検出器（FID）を使用して：165における低温始動°Cは、1の増加が続く3分間、ホールド℃/ 195分℃まで、第二に続いて40分間、保持最大240°C /分℃、10分間保持する10の増加となりました。定圧モード（29 PSI）が選ばれています。ヘリウムや水素をキャリアガスとして使用することができます。メチルエステルは、本物のサンプルの保持時間と比較することによって識別されます。 図10は、血漿コレステリルエステルから得られたFAMEの代表的なGC分析を示しています。 5。の合成（5'R） – および（5'S）-5 '、8 – シクロ-2'-デオキシアデノシン 1mMの濃度に到達するために、アセトニトリル（100ml）中の8 – ブロモ-2'-デオキシアデノシンの33ミリグラム（の8-Br-腰羽目）を溶かす。光反応器内のガス流量（Ar又はN2）を規制し、APPAを埋めるの8-Br-腰羽目の溶液でratus。 光反応器の入力に適したサイズとセプタムを準備して、それの中心を通って不活性ガスラインに接続された針を渡します。セプタムでシステムカバーを閉じます。 30分間、不活性ガスをフラッシュします。 22℃で125W中圧水銀灯を用いて紫外線による照射±2℃で15分間、250mlの丸底フラスコに溶液を回収。 10mlのアセトニトリルで光反応器を洗い、同じフラスコ内の洗浄液を回収する。 1 MのNH 4 OH溶液と粗反応混合物をクエンチし、ロータリーエバポレーターで溶媒を蒸発させる。 既知の条件下で分析カラムによる高速液体クロマトグラフィー分析（HPLC-UV）を（インストゥルメンテーションの項を参照）を実行し、参照化合物を使用してプロファイルを比較します。 以下のゾルを用いて分析カラム（インスツルメンテーション·セクションを参照してください）​​、高性能液体クロマトグラフィー分析（HPLC-UV）を実行通気口やグラデーション：2 mMギ酸アン​​モニウムを溶媒として、アセトニトリル溶媒Bは1ミリリットル/分および2.2分で到達するために0％溶媒Bから0.3％溶媒Bの勾配に流量を設定として。その後、4.0分、4.8分の1％溶媒Bの中で、0.8％溶媒B。 9分に1％溶媒Bのままで、その後6分間で8％溶媒Bに進みます。 4分で10％溶媒Bに行くと30％溶媒B〜5分で、他の5分で30％溶媒Bで推移した後。二つの異なるバイアル内の2つのジアステレオマーの製品に対応するクロマトグラムのピークを収集します。 UV分光光度計で2回収した画分の吸光度を測定し、産期の雌羊·ベールの法則（吸光度=εlC、ε吸光係数とlセルの長さ）に基づいて正確な濃度を計算します。 2'-デオキシアデノシンの吸光係数ε（茶道）（260 nmで15400 M -1 cm -1）を使用します。 6。の合成（5'R） -D（5'S）-5 '、8 – シクロ-2'-デオキシグアノシンそれぞれ1mmと2mMの濃度に到達するために、蒸留水（100ml）中の8 – ブロモ-2'-デオキシグアノシン35mgの（8-BR-dGuo）およびヨウ化ナトリウム（NaI）の30 mgを溶解します。光反応器に接続されている不活性ガス（ArまたはN 2）の流れを調節し、反応溶液を光反応器を埋める。 （ステップb）の手順5で説明したように、反応混合物を脱気。 22℃で125W中圧水銀灯を用いて紫外線による照射±2℃で30分間、250mlの丸底フラスコに溶液を回収。 10mlの水で光反応器を洗い、同じフラスコ内の洗浄液を回収する。 1 MのNH 4 OH溶液と粗反応混合物をクエンチし、真空下で溶媒を蒸発させる。 （gのステップe）の手順5で説明したように分析を実行します。 2'-デオキシグアノシンの吸光係数ε（dGuo）（260 nmで11700 M -1 cm -1）を使用します。 7。同位体標識されたプリン（5'R）の合成 – （5'S）-5 '、8 – cyclonucleosides セプタムキャップ付きガラスバイアル（4mL）中の15 Nの同位体標識されたプリンヌクレオシドの1mMの水溶液（蒸留水）（[15N 5]腰羽目または[15N 5] dGuo）2 mlを準備します。 セプタムキャップでバイアルを接続して、バイアルの底に達した中隔の針を通してガスライン（溶液の飽和のために、N 2 O）に接続します。セプタムキャップ内の別の短い針がガス出口として働いています。 30分間N 2 Oを備えたソリューションをフラッシュします。ガスの流れは非常に低くなるように調整される。 出口の針が最初取り出して1 'の後に長い1は、バイアルの中に小さな圧力を持たせるために、次のされています。 8時間（線量率約4.5 Gyで/分の単位で計算）のガンマ放射線分解の装置で溶液を入れた。 反応後、1M NH 4で原油をクエンチ</sUB> OH溶液。 6、既知の条件下で高速液体クロマトグラフィー分析（HPLC-UV）を実行し、標準的な参考文献とクロマトグラムを比較します。 8。 DNA水溶液のガンマ放射線分解ウシ胸腺DNAの0.5 mg / mlの溶液1ml（蒸留水）を準備し、セプタムキャップ付きガラスバイアル（2ml）中に入れた。 （ステップBD）手順7で説明したように反応を脱気。 30分（用量/速度約4.5 Gyで/分の単位で計算）のガンマ放射線分解の装置で溶液を入れた。 9。 DNAの酵素消化 DNAの80μgを含むエッペンドルフチュー​​ブに、ヌクレアーゼP1、ホスホジエステラーゼII、300 mMの酢酸ナトリウム（pH 5.6）、10mMの塩化亜鉛20μl中EHNA 20 nmolの0.01 Uの8 Uを追加します。 48時間37℃で混合物をインキュベートする。 次にphosphodiesteras 0.02 U、アルカリホスファターゼの8 Uの混合物を追加E私は、混合物の消化に0.5Mトリス – 塩酸緩衝液（pH 8.9）40μlのインチサンプルを2時間37℃でインキュベートする。 混合物を10％ギ酸を加えて中和する。 アミコンウルトラ0.5遠心フィルター装置（カット3kDaの）にサンプルを移し、tridistilled H 2 Oの200μlを加える15分間、14,000×gで遠心ローターに超フィルターを置きます。その後、遠心管からウルトラフィルタ装置を分離します。マイクロチューブに酵素を含まない溶液を凍結乾燥。 10。分析に先立ってDNAサンプル淡水化分析カラムによる高速液体クロマトグラフィー分析（HPLC-UV）（インストゥルメンテーションのセクションを参照）、既知の条件に従って。6実行 H 2 O20μlに凍結乾燥消化されたDNAを溶解し、HPLC-UVで注入する。 塩溶出（最初の数分間）の後、右溶出ティム前にバイアルにサンプルを収集クロマトグラフィープログラムの終了時まで先制ヌクレオシド（5'R-cdGuo）のe。 試料を凍結乾燥し、20μlの水に再溶解されています。 11。 LC-MS/MS定量分析分析法およびMS検出器（ESI）をするための方法をロードすることによって、分析を開始する前にHPLC-MS/MS（トリプル四重極）を準備します。6 手順7で調製したサンプルの同位体標識化合物の混合物の1μlを添加する。 蒸留水でスパイク消化されたDNA溶液20μlを注入します。 得られたクロマトグラフデータは、参照化合物との以前のキャリブレーションに基づいて詳しく説明されます。代表的なHPLCは、アデノシン、2'-デオキシグアノシンを含むとその酸化およびシクロ誘導体は図11に示されて実行されます。