Free Radicals in Chemical Biology: van chemische gedrag tot Biomarker Development

1. Synthese van Mono-transisomeren van cholesterylesters Los cholesteryl esters (linoleaat of arachidonaat cholesteryl ester) in 2-propanol (15 mM). Voor een betere oplosbaarheid, werden de monsters 15 min gesonificeerd onder argon. Breng de oplossing een kwarts fotochemische reactor, voeg 2-mercaptoethanol in 2-propanol (7 mM concentratie bereiken van een 2 M voorraadoplossing van de thiol). Spoelen van het reactiemengsel met argon gedurende 20 min om de aanwezigheid van zuurstof in de oplossing te verwijderen. Het reactiemengsel bestralen met UV-licht met een 5.5W lagedruk kwiklamp bij 22 ± 2 ° C gedurende 4 minuten. Monitor door analytische TLC-Ag (zilver-dunnelaagchromatografie) dat hij de vorming van het mono-trans cholesteryl esters (zie figuur 1 voor de chemische formules). De TLC kleuring wordt uitgevoerd door gieten plaat in de ceriumammoniumnitraat molibdate (CAM) oplossing, en de vlekken bij verhittingde plaat. Quench de reactie in een vroeg stadium, om het uitgangsmateriaal, dat kan worden hergebruikt voor andere rondes isomerisatie verkrijgen van een verhoging van de totale opbrengst voeren herstellen. Verzamel het reactiemengsel in een rondbodemkolf, wassen van de inrichting met enkele ml 2-propanol. Verwijder oplosmiddel en zuiver het mono-trans isomeren van cholesteryl esters door Ag-TLC zoals beschreven in de literatuur. 5 Gebruik hexaan-diethylether (9:1 v / v) als eluens voor mono-trans isomeren cholesteryl linoleaat, dat gebruik hexaan -diethyl ether-azijnzuur (9:1:0,1 v / v) voor mono-trans cholesteryl arachidonaat isomeren. 2. Isolatie van cholesterylesters fractie uit humaan serum Verdun 1 ml humaan serum (verkregen door centrifugeren van bloed) met 1 ml pekel en giet het mengsel in een scheitrechter onder een stroom argon om artefacten (bijvoorbeeld oxidatie adducten) voorkomen. Voeg 10 ml chloroform-methanol (2: 1 v / v) driemaal. Schud de scheitrechter zeer langzaam om de vorming van de emulsie door de aanwezigheid van albumine beperken. Ze wast de organische lagen met pekel (10 ml), verzamel dan in een Erlenmeyer kolf onder een argonstroom, droog over watervrij natriumsulfaat. Verwijderen vluchtige stoffen door roterende verdamper tot een gele olie (totaal plasma lipide fractie) werd verkregen. Neem het ruwe met 1 ml chloroform-methanol (2:1 v / v), laden op een preparatieve TLC onder een stroom argon en een mengsel van hexaan-diethylether (9:1 v / v) als eluens . Schraap de silica gedeelte met de cholesterylester fractie en giet het in een flesje. Vervolgens extract silica (3 x 5 ml) met chloroform-methanol (2:1 v / v), verzamelt de organische lagen en verwijder het oplosmiddel na verdamping van de zuivere fractie van cholesterylesters (meestal ~ 1,5 mg) werd verkregen. Houden cholesteryl esters in een donkere fles onder aluminiumfolie onder argon en bij -20 ° C. Cholesteryl esters zijn gevoelig voor licht en zuurstof. 3. Karakterisering van Mono-trans cholesterylesters door Raman Spectroscopy Uittreksel cholesteryl esters uit humaan serum (≥ 0,7 mg) zoals beschreven in hoofdstuk 2, oplossen in een kleine hoeveelheid tetrachloorkoolstof (≤ 10 pl) en in een flesje. CCl4 geselecteerd als oplosmiddel omdat de Raman-signaal niet overlapt met het gebied van belang van cholesterylester analyse. Breng de oplossing van de monsterhouder door een wegwerp glazen pipet, verwijder voorzichtig het oplosmiddel een langzame argonstroom. Zodra een uniform olieachtige film wordt gevormd op de binnenwand van de monsterhouder, plaatst deze in het instrument voor de meting. Fourier Getransformeerde Raman spectrum van cholesterylesters direct opgehaald op lipide extracten zonder derivatisering reactie. Het laservermogen op het monster <100 mW tot monster te voorkomen. Het aantal scansvoor elk spectrum is ≥ 800 tot de ruis te minimaliseren. De 1,700-1,630 cm -1 bereik van het Raman spectrum wordt geanalyseerd aangezien weerspiegelt de bijdrage van de C = C dubbele bindingen in het molecuul (C = C strekken mode). Een curve fitting analyse is op dit gebied, zodat het onderscheiden van de bovenliggende bijdragen van cis en trans dubbele bindingen in de vetzuren alkylketen en dubbele binding in de ring B van cholesterol (zie figuur 2). Om correct de vibrationele banden passen, moet een aantal parameters worden vastgesteld of beperkt binnen redelijke grenzen. De component piek profielen worden beschreven als een lineaire combinatie van Lorentz en Gaussian functies, terwijl de halve hoogte bandbreedtes best bepaald door de computer optimalisatie routine. Het aantal en de positie van de component pieken worden verkregen door de vierde afgeleide spectra, waardoor ook gedetecteerd in zwakke component bands. Aangezien het signaalruisverhouding die verslechtert na differentiatie van het signaal uitsluit dat de vierde derivaat, vierde derivaten gladgemaakt met een dertien punten Savitsky-Golay functie zijn van voordeel, dus recht compromis tussen resolutie en signaal-ruisverhouding wordt verkregen . De beste curve-fitting worden verkregen op het laagst mogelijke c 2 waarden. De aanwezigheid van trans-isomeren blijkt uit de component 1671 ± 1 cm -1, naast ten minste twee elementen, iets verschoven naar lagere frequenties vanwege de vetzuurketen en cholesterol C = C-dubbele bindingen. Representatieve Raman spectrum van plasma cholesterylester wordt getoond in figuur 9. In de inzet de vergelijking van een specifieke regio cholesteryl linoleaat en mono-trans cholesteryl linolzuur isomeren getoond. 4. Derivatisering naar Fatty Acid Methyl Esters (FAME) en analyse met gaschromatografie Ontbindencholesteryl esters (~ 1,5 mg) met 0,5 ml van een 1 M oplossing van natriumhydroxide in benzeen-methanol (2:3 v / v) en in een donkere fles onder aluminiumfolie onder argon. Laat het mengsel roeren bij kamertemperatuur en monitor TLC met een mengsel van hexaan-diethylether (9:1 v / v) als eluens. Reactietijd bedraagt ​​doorgaans 30 min maar een zorgvuldige reactie controle vereist. In feite, zodra de overeenkomstige methyl esters worden gevormd, moet de reactie worden afgeschrikt om de vorming van afbraakproducten en bijproducten te vermijden. TLC toonde de kwantitatieve vorming van methylesters. Quench het reactiemengsel door 1 ml pekel en extraheren methyl esters met n-hexaan (3 x 2 ml). Breng de organische lagen in een flesje en verwijder het oplosmiddel door verdamping onder rotatie de methylester fractie, die dan voor GC-analyse gebruikt zonder verdere zuivering verkregen. Los de methylesters in de minimum hoeveelheid n-hexaan (gewoonlijk 1 mg in 50 pi) en injecteer in de GC met een 60 m x 0,25 mm x 0,25 urn (50%-cyaanpropyl)-methylpolysiloxane kolom. Gebruik een vlamionisatiedetector (FID) met de volgende oven programma start temperatuur bij 165 ° C, gedurende 3 min, gevolgd door verhoging van 1 ° C / min tot 195 ° C, houden gedurende 40 minuten, gevolgd door een tweede verhogen van 10 ° C / min tot 240 ° C en houd gedurende 10 minuten. Een constante druk mode (29 psi) wordt gekozen. Helium of waterstof worden gebruikt als dragergas. Methylesters worden geïdentificeerd door vergelijking met retentietijden van authentieke monsters. Figuur 10 toont een representatief FAME GC-analyse van plasma verkregen cholesterylesters. 5. Synthese van (5'R) – en (5'S) -5 ',8-cyclo-2'-deoxyadenosine Los 33 mg van 8-broom-2'-deoxyadenosine (8-Br-Dado) in acetonitril (100 ml) om 1 mM concentratie te bereiken. Regeling van de gassnelheid (Ar of N2) in de fotoreactor en vul de appatellen in de oplossing van 8-Br-Dado. Bereid een septum met de juiste grootte voor de ingang van de fotoreactor en passeren een naald verbonden met het inerte gas lijn door het midden van het. Sluit het systeem met de septum. Spoel de inert gas gedurende 30 minuten. Bestralen met UV-licht met een 125W medium kwiklamp bij 22 ± 2 ° C gedurende 15 min, de oplossing verzameld in een 250 ml rondbodemkolf. Was de fotoreactor met 10 ml acetonitril en verzamelen wassen in dezelfde kolf. Quench het ruwe reactiemengsel met 1 M NH4OH oplossing en damp het oplosmiddel in een rotatieverdamper. Run HPLC-analyse (HPLC-UV) met analytische kolom (zie instrumentatie sectie) onder bekende omstandigheden, en vergelijken het profiel met referentie verbindingen. Run HPLC-analyse (HPLC-UV) met een analytische kolom (zie instrumentatie sectie) met behulp van de volgende solopeningen en gradiënten: 2 mM ammoniumformaat als solvent A en acetonitrile als solvent B. Stel het debiet van 1 ml / min en gradiënt van 0% solvent B tot 0,3% solvent B wordt bereikt in 2,2 min. Dan 0,8% oplosmiddel B in in 4,0 min, vervolgens 1% solvent B in 4,8 min. Blijf op 1% oplosmiddel B voor 9 min en ga vervolgens naar 8% oplosmiddel B in 6 minuten. Na naar 10% oplosmiddel B in 4 min en 30% solvent B in 5 min en blijven 30% solvent B gedurende 5 min andere. Verzamel de chromatografische pieken die overeenkomen met de twee diastereomere producten in twee verschillende flesjes. Meet de absorptie van de twee fracties opgevangen in de UV spectrofotometer en bereken de exacte concentratie op basis van het Lamber-Beer wet (A = εlC, waarbij A de absorptie, ε de extinctiecoëfficiënt en l de lengte van de cel). Gebruik de extinctiecoëfficiënt ε van 2'-deoxyadenosine (Dado) (15.400 M-1 cm-1 bij 260 nm). 6. Synthese van (5'R) – eend (5'S) -5 ',8-cyclo-2'-deoxyguanosine Los 35 mg van 8-broom-2'-deoxyguanosine (8-Br-dGuo) en 30 mg natriumjodide (Nal) in gedestilleerd water (100 ml) om 1 mM en 2 mM respectievelijk concentratie bereiken. Reguleren inert gas (Ar of N2) stroom verbonden met de fotoreactor en vul de fotoreactor met de reactieoplossing. Degass het reactiemengsel zoals beschreven in procedure 5 (stap b). Bestralen met UV-licht met een 125W medium kwiklamp bij 22 ± 2 ° C gedurende 30 min, de oplossing verzameld in een 250 ml rondbodemkolf. Was de fotoreactor met 10 ml water en het verzamelen van wassen in dezelfde kolf. Quench het ruwe reactiemengsel met 1 M NH4OH oplossing en damp het oplosmiddel onder vacuüm. Voeren analyse zoals beschreven in Procedure 5 (stap E tot G). Gebruik de extinctiecoëfficiënt ε van 2'-deoxyguanosine (dGuo) (11.700 M-1 cm-1 bij 260 nm). 7. Synthese van Isotopische Labeled Purine (5'R) – en (5 'S) -5' ,8-cyclonucleosides Bereid 2 ml van 1 mM waterige oplossing (gedestilleerd water) van de 15 N isotopische label purinenucleosiden ([15N 5] Dado of [15N 5] dGuo) in een glazen flesje (4 ml) met een septumdop. Sluit de flacon met de septumafsluiting en sluit de gasleiding (N 2 O verzadiging van de oplossing) door een naald in het septum dat de bodem van het flesje bereikt. Een andere korte naald in de septumafsluiting werkt als het gas af te sluiten. Spoel de oplossing met 2 O N gedurende 30 minuten. De gasstroom wordt zo geregeld dat deze zeer laag. De uitgang naald wordt eerst afgesloten en na 1 'lang volgt om een ​​kleine druk in de flacon hebben. Plaats de oplossing in de inrichting gamma radiolysis gedurende 8 uur (berekend op basis van een dosis ca. 4,5 Gy / min). Na reactie blussen van de ruwe olie met 1 M NH 4 </sub> OH-oplossing. Run HPLC-analyse (HPLC-UV) onder bekende omstandigheden, 6 en vergelijk het chromatogram met de standaard referenties. 8. Gamma radiolyse van DNA waterige oplossingen Bereid 1 ml van 0,5 mg / ml oplossing (gedestilleerd water) van kalfsthymus DNA en in een glazen flacon (2 ml) met een septumafsluiting. Degass de reactie als beschreven in Procedure 7 (stappen bd). Plaats de oplossing in de inrichting gamma radiolysis gedurende 30 min (berekening op basis van dosis / rate ca. 4,5 Gy / min). 9. Enzymatische digestie van DNA Een Eppendorf buis met 80 ug DNA, voeg 8 U nuclease van P1, 0,01 U van fosfodiësterase II, 20 nmol van EHNA in 20 pl 300 mM natriumacetaat (pH 5,6) en 10 mM zinkchloride. Incubeer het mengsel bij 37 ° C gedurende 48 uur. Voeg vervolgens een mengsel van 8 U alkalische fosfatase, 0,02 U van phosphodiesterase I, in 40 pl 0,5 M Tris-HCl buffer (pH 8,9) aan mengsel spijsvertering. Het monster wordt geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 2 uur. Het mengsel wordt geneutraliseerd door toevoeging van 10% mierenzuur. Breng het monster een Amicon Ultra-0.5 centrifugale filterinrichting (3 kDa cutoff), voeg 200 ul tridistilled H 2 O. Plaats de Ultra-filter in de centrifuge rotor bij 14.000 xg gedurende 15 minuten. Dan scheiden de Ultra filter apparaat van de microcentrifugebuis. Lyofiliseren het enzym-vrije oplossing in de microcentrifugebuis. 10. DNA-monster ontzilting voorafgaand aan de analyse Run HPLC-analyse (HPLC-UV) met analytische kolom (zie paragraaf instrumentatie) na bekende omstandigheden. 6 Los het gevriesdroogde gedigereerd DNA in 20 ul H2O en injecteer in HPLC-UV. Verzamel het monster in een flesje nadat het zout elutie (eerste minuten) en vlak voor de elutie time van het eerste nucleoside (5'R-cdGuo) tot het einde van de chromatografische programma. Het monster wordt gelyofiliseerd en resolubilized in 20 pi water. 11. LC-MS/MS Kwantitatieve Analyse Bereid de HPLC-MS/MS (triple quadrupole) voordat de analyse van het laden van de analysemethode en de wijze van MS detector (ESI). 6 Voeg 1 ul van de isotopische gemerkte verbindingen mengsel in het monster bereid in Procedure 7. Injecteer 20 pi van het verrijkte gedigereerd DNA oplossing in gedestilleerd water. De verkregen chromatografische data worden uitgewerkt op basis van eerdere kalibratie met referentieverbindingen. Een vertegenwoordiger HPLC run met adenosine en guanosine 2'-deoxyribonucleosides en hun oxidatieve en cyclo derivaten is weergegeven in Figuur 11.