高通量，自动化的DNA和RNA的提取从临床样品使用TruTip技术常见的液体处理机器人

三的自动化TruTip提取协议描述，这里演示：1）中等通量RNA提取的Eppendorf epMotion 5070 NPA 2）高通量基因组DNA提取从全血汉密尔顿STAR量低，和3）选择性分离母体血浆量汉密尔顿的Starplus上从大的支离破碎的胎儿DNA富集。自动的脚本能从Akonni和只有高级程序描述符在这里提供。的提取和洗脱试剂都是自动从批量试剂槽分配到96孔板中的自动脚本（次）前处理的临床样品。 1。自动RNA提取鼻咽分泌物先前所描述的的手动TruTip方法15现在适应的Eppendorf epMotion 5070液体处理机器人上运行，使用1.0毫升的Eppendorf管中的的大孔隙TruTip矩阵嵌入式TTE提示，2毫升的深孔板（美国科学），Akonni的提取TruTip试剂，作为样品类型和NPA。 epMotion 5070液体处理机器人最多可容纳8个技巧的同时，使基线自动化协议描述为8位并行提取。然而，可以处理多达24个样品，在一个单一的程序在一个深水井96孔样品板。一个单独的epMotion程序（和）以16或24个样品进行处理。下面列出的是该协议8自动化脚本示例。 格局鼻咽样本带来RT开始前提取。 分配100μL鼻咽分泌物加150无核酸酶的水倒入样品板（ 图2A）第1栏。 将样品板到位置B1上的的epMotion工作台（ 图2B）。 将枪头，的TruTips和30毫升试剂槽到各自的epMotion Worktab的中的文件的位置（ 图2B）。 打开的Eppendorf epBlue软件，选择“运行文件由Akonni提供8个样品，并点击运行按钮”运行“选项卡上加载的方法。 根据液位传感器设置，选择水平和技巧，然后单击“运行”按钮。 到软件输入样品的体积，然后单击“运行”。 该的epMotion脚本将提示用户添加萃取和洗脱试剂试剂水库位于工作台位置B2。添加每种试剂的推荐量到各自的低谷。对于8个样品中，最小的试剂量是： 试剂 体积（ml） 海槽位置 95％乙醇 3.5 2 洗涤缓冲液D 9 3 洗涤液ê 9 </tD> 4 洗脱缓冲A2的 1.3 5 裂解并绑定缓冲液D 11.0 6 输入试剂卷epMotion软件时提示从上面的步骤8成表。输入值应反映到每个相应的试剂槽由用户分配的缓冲区的实际体积，必须大于或等于上面提到的最小体积。卷项不正确，可能会导致不正确的体积在96 – 孔板（次）由的epMotion硬件的每个管或交付。 自动化程序选择RUN启动自动化的方法。自动化脚本将移动没有用户干预的情况下通过以下步骤进行： 裂解样品和试剂分配： 免除375μL裂解缓冲液D 1列混合10的周期（apirate +免除= 1周期）。这一步开始裂解孵化过程中，而其余试剂等分。 免除1.6毫升的洗涤液D进入第2列。 免除1.6毫升的洗涤液E组成3栏。 免除50μL洗脱缓冲液A进入第4列。 暂停6分钟完成10分钟取样培养裂解液D. 在第1列，每孔加入375μL乙醇，通过与乙醇混合每个样品10个吹打周期。 提取： 将装入8 TruTips从位置A2工作台，并开始提取过程如图1所列。 吸入和排出样品/裂解缓冲/乙醇混合物的样品板的第1列的七个周期绑定的核酸的TruTip巨石。虽然样品通过TruTip流可能有所（由于临床样品的粘度差异），这些样品的核酸产量没有吨流量变化的影响。在讨论提高样品流的选项。 将移动TruTips样板柱2，循环洗涤缓冲液D 5x的过巨石，以去除残留的裂解液样品基质。 将移动TruTips样板柱3，循环洗涤缓冲液ê5x的过巨石去除蛋白质结合的核酸和其他污染物。 将移动TruTips空试剂瓶位置1（在工作台位置B2），和周期80X（在流速快）干的巨石。重要的是要彻底干燥的TruTip，洗脱的核酸制剂中的残留溶剂将产生负面影响酶，如逆转录酶和Taq DNA聚合酶。 移动TruTips样板柱洗脱缓冲A. 4和周期的5倍，提取和纯化核酸是现在在洗脱缓冲液中样品板式塔4口井。 的epMotion垃圾桶中弹出TruTips“。 <li>当程序完成后，以手动方式从仪器中取出的样品板和纯化的核酸转移到新的管中，用于长期贮存或进一步使用。高级的epMotion用户可以添加指令运行文件转移到单独的存储管或PCR板块的洗脱样品，如果需要的话。 总共16个样本的程序将重复步骤10.1至10.13用样品板列5-8。对于24个样品的程序，步骤10.1重复通过10.13 2X使用样板5-8和9-12，分别列。 2。 96从全血中提取基因组DNA 汉密尔顿STAR液体处理机器人可用于同时显示96个样品的自动提取，从全血中。哈密​​尔顿星不同于的epMotion系统的一个可选的加热器/摇床单元可在甲板上，这是重要的临床目标酶消化校准矩阵，如全血。一个96通道的移液管头，因为该系统可以配备有一个专用的96孔板的每个的TruTip的步骤和试剂。 格局打开仪器和计算机上的STAR。 打开汉密尔顿运行控制软件。 打开运行文件96个样品Akonni。 将实验器具的STAR甲板上， 如图3所示。 免除到相应的槽（卷表示至少需要处理96个样品）试剂： 试剂 体积（ml） 海槽位置 裂解和结合缓冲液F 75 5 95％乙醇 100 6 洗涤液Ĵ 175 7 洗缓冲区K表 175 8 洗脱缓冲A2的 12 9 蛋白酶K（20毫克毫升-1） 8 15 6。允许样品平衡至RT。 7。将样品管样品载波架（甲板图3中的位置4）。样品1的背面最左边的载体，并依次向下移动每个载波样品96的结局在右前方的位置。 自动化程序选择运行文件左上角的窗口和输入的数量正在处理样品中的播放按钮。自动化的脚本，然后移动没有用户干预的情况下通过以下步骤进行： 样品溶解和试剂分配 从每个样品管中加入200μl转移到培养板，在第14位上的他亚特/：摇床模块（ 图3）。 分配80μL蛋白酶K孵化板到每个样品。 在进入孵化板每孔600μL裂解缓冲液F免除。 混合溶液进行10个循环，然后在70℃和500rpm下孵育20分钟。的70℃的设定温度在〜60℃下的样品的温度在深孔板蛋白酶K的活性的范围内，这是内。虽然样品孵化，液体处理系统继续工作由分配到相应的板块和水井试剂： 加入100μl洗脱缓冲液A到13位的深孔板的各孔中。 到10位的深孔板的各孔中的800微升乙醇。 1.6毫升的洗涤缓冲液Ķ到位置12深孔板的各孔中。 1.6毫升的洗涤缓冲液Ĵ到11位的深孔板的各孔中。 <li孵育20分钟后，从培养板的样品混合物转移到10位的深孔板，并通过移液12次混合。 弹出试剂提示垃圾桶。 萃取此部分的基因组DNA的血过程是非常相似的的epMotion流感协议，除了洗涤组合物，试剂和循环数。汉密尔顿TruTips提示是黑色的，所以液体的流动通过TruTip是不可见的。 将96 TruTips从甲板位置3。 吸入和排出的样品/裂解缓冲/乙醇混合物于10周期结合核酸到TruTip巨石位置10。 将TruTips移动到位置11和循环洗涤缓冲液Ĵ5x的过巨石，以去除残留的裂解液样品基质。 移动TruTips的位置12和循环洗涤缓冲液K表5倍，去除蛋白质和其他污染物结合的核酸。 </li> 循环TruTip 40X高速风干。 将移动TruTips位置13和周期在洗脱缓冲A2 5倍。的提取和纯化的核酸是现在在洗脱缓冲液中的深孔板。 垃圾桶弹出TruTips。 当程序完成后，取出洗脱从仪表板和提取的样品转移到相应的管存储或下游应用。 3。大体积的血浆样本的DNA提取汉密尔顿的Starplus仪器是用来证明自由提取循环从5毫升母体血浆胎儿DNA的自动化协议。 STARPLUS系统可以支持两种自动移液器通道臂，一个8×5毫升渠道和8×1毫升渠道之一。这些武器可以并行工作，在每个批次的8个样品进行交错处理。 5毫升TruTip用于初始升阿尔赫体积萃取，和1毫升TruTip的用于规模分离和进一步浓缩的提取的核酸。 设置打开STARPLUS仪器和计算机。 打开汉密尔顿运行控制软件。 打开运行文件由Akonni提供8大体积的血浆样本。 如在图4中所示将实验器具到的Starplus的甲板上。 免除到相应的水库试剂： 试剂 体积（ml） 海槽位置 CN-W1 17 5A CN-W2 17 5B CN-W4 21 5C 蛋白酶K（20毫克毫升-1） 5 6A EBB 17 </tD> 6B EBA2 5 6C CN-W3 5 6D CN-B2 5 6E CN-B3 5 6F CN-L1 52 7 CN-B1 175 8 允许样品平衡至室温。 将样品管样品载波架（甲板位置3 图4）。将样品1在后方朝向前方的甲板上顺序地移动。 自动化程序由于大的输入的样品体积，必须进行裂解和均质化步骤，在水浴中汉密尔顿的Starplus仪器。步骤无需用户干预的自动化协议内有星号（*）表示在搁克的句子，和大胆的类型 。 裂解样品和试剂分配：样品用蛋白酶K和裂解缓冲液中温育的样品均匀化，并释放DNA。 选择左上角的“运行文件”窗口中的播放按钮。正在处理的输入的样本数，在甲板上的移液吸头的位置，在甲板上的位置TruTips。 的自动脚本。添加615微升的蛋白酶K，5毫升血浆，和6.2毫升的裂解缓冲液CN-L1每次50毫升锥形管，然后将PAUSE（暂停）。 *从样品甲板，旋涡中取出50毫升锥形管高速30秒，脱机，孵育30分钟，在60℃水浴或者加热块。锥形管后从汉密尔顿甲板，删除恢复的自动化脚本将继续分配到各自的板和井（ 图4B及4C）试剂： <ul> 2毫升CN-W1以及所有其他位置的9列1。 2毫升CN-W2以及所有其他位置9列2。 2毫升CN-W4以及所有其他位置9 3栏。 250微升EBA2的每隔以及在第9位4和5栏。 495微升CN-B2以及所有其他的在位置10列1。 1毫升EBB以及所有其他位置10列2。 500微升CN-W3以及所有其他位置10第3栏。 500微升CN-W4位置以及所有其他的10列4。 50微升EBA2的以及所有其他位置10第5列。 因为每个样品使用邻井，自动化程序无需试剂以及深孔板在甲板位置9到每一个其他的5毫升通道太宽。机械手臂使用1毫升通道也需要使用其他每个试剂板以及排斥和浓度STEPS的协议。 胶试剂后，程序将会暂停。 *，60℃温育30分钟后，将50毫升锥形管在冰上5分钟。 *返回到原来的位置50 ml锥形管内的样品载体机架在甲板位置4，和恢复的自动化脚本。 添加12毫升结合缓冲CN-B1每个样品管中混合10倍。 大体积提取：使用5毫升TruTips提取总DNA裂解血浆样本。 拿起从位置2大体积的核酸提取5毫升TruTips。 周期样品mixture15时间在50毫升锥形管，在管的底部，并开始移动3毫米每个移液周期后。此步骤的总核酸到TruTip整体式绑定。 深孔板将TruTips移动位置1，第6纵队和cy第一百1X洗涤液CN-W1。 移动TruTips 9列2和CN-W2洗周期1X定位。 将TruTips移动定位9列3和周期2个洗C​​N-W4。 移动的定位TruTips 9列4和周期的40倍，在高速干结合矩阵。 将TruTips移动的位置9的第5栏和周期的10倍，以洗脱结合的核酸从5毫升TruTips的。这是大体积洗脱＃1。 将移动TruTips塔6，并与第二洗脱缓冲液的等分试样中重复的步骤。这是大体积洗脱＃2。 转移洗脱＃2到9位第5列，结合它与洗脱＃1，并丢弃TruTips的。 从所提 ​​取的样本中，被删除的排斥与浓度：高分子量DNA和其它DNA是孤立并浓缩。 新增合并洗脱液从第22步到10柱1定位调匀10倍。 拿起1毫升TruTips的从位置13和周期20倍的高分子量DNA绑定到单块。 移动的的定位TruTips 10列2和5倍周期冲洗小费和删除超高分子量DNA。该的保留TruTips 13位尖架放回。 用试剂提示位置12，加575μL结合缓冲CN-B3位置10列1和混合10倍的样品。 如拿起从步骤25 TruTips，返回10柱1，周期20X绑定其余的从样品DNA 1毫升TruTip，定位。 移动TruTips，定位10列4周期1X洗CN-W3删除任何剩余的抑制剂。 移动的的定位TruTips 10第5列和CN-W4在洗涤周期1X冲洗残留盐CN-W3。 提高位置TruTips超过10第5列和循环空气通过提示35X干巨石。 移动的位置TruTips 10列6和循环在EBA2 10倍洗脱纯化，大小选择性泰德和浓核酸。 丢弃TruTips。 转移的从塔6到第11位的1.5 ml微量离心管中洗脱样品。提取的样品是准备用于存储或下游加工。