JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

بي ار بي كنهج جديد للوقاية من العدوى: إعداد و<em> في المختبر</em> الخصائص المضادة للميكروبات من PRP

Published: April 09, 2013
doi:
10.3791/50351
,
1Department of Orthopaedics, School of Medicine,West Virginia University , 2Department of Orthopaedics, Stem Cell Research Center,University of Pittsburgh, 3WVNano Initiative, 4Mary Babb Randolph Cancer Center

Summary

Implant-associated infection is a significant clinical complication. This study describes an approach using platelet-rich plasma (PRP) to prevent implant-associated infections, presents the protocol for preparing PRP with constant platelet concentration, and reports the newly identified antimicrobial properties of PRP and related protocols for examining such antimicrobial properties in vitro.

Abstract

زرع المرتبطة العدوى أصبحت أكثر وأكثر تحديا لقطاع الرعاية الصحية في جميع أنحاء العالم نتيجة لزيادة المقاومة للمضادات الحيوية، ونقل البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية بين الحيوانات والبشر، وارتفاع تكلفة علاج التهابات.

في هذه الدراسة، ونحن تكشف عن استراتيجية جديدة قد تكون فعالة في منع الإصابة زرع المرتبطة يعتمد على خصائص مضادة للميكروبات المحتملة للالصفيحات الغنية البلازما (PRP). نظرا لخصائص مدروسة من أجل تعزيز الشفاء، وقد تم PRP (منتج البيولوجية) تستخدم بشكل متزايد للتطبيقات السريرية بما في ذلك جراحة العظام، جراحة اللثة والفم، والعمليات الجراحية الوجه والفكين، عمليات التجميل، الطب الرياضي، الخ.

يمكن أن تكون بديلا PRP متقدمة للعلاجات بالمضادات الحيوية التقليدية في منع زرع المرتبطة الالتهابات. فإن استخدام PRP يكون من المفيد مقارنة العلاج بالمضادات الحيوية التقليدية الاشتراكيةNCE PRP هو أقل عرضة للحث على مقاومة المضادات الحيوية ومضادات الميكروبات وPRP والخصائص العلاجية المعززة للقد يكون له تأثير متناغم لمنع العدوى. فمن المعروف أن مسببات الأمراض والخلايا البشرية تتسابق للأسطح زرع، وخصائص الشفاء PRP لتعزيز يمكن أن تحسن مرفق الإنسان الخلية مما يقلل من احتمالات للعدوى. وبالإضافة إلى ذلك، هو PRP حيويا بطبيعتها، وآمنة وخالية من خطر الأمراض المعدية.

لدراستنا، وقد اخترنا عدة سلالات بكتيرية السريرية التي توجد عادة في التهابات العظام وفحص ما إذا كانت لديه PRP في خصائص مضادة للميكروبات المختبر ضد هذه البكتيريا. قمنا بإعداد PRP باستخدام نهج الطرد المركزي مرتين والذي يسمح ليتم الحصول على نفس التركيز الصفائح الدموية لجميع العينات. حققنا نتائج متسقة المضادة للميكروبات، ووجدت أن لديه PRP قوية في خصائص مضادات الميكروبات في المختبر ضد البكتيريا مثل ميثيسيلين حساسة ومقاومة للميثيسيلين المكورات العنقودية الذهبية، العقدية المجموعة A، والنيسرية البنية. لذلك، فإن استخدام PRP لديها القدرة على منع العدوى والحد من الحاجة للعلاج بعد العملية مكلفة من زرع المرتبطة الالتهابات.

Introduction

زرع المرتبطة العدوى هو اختلاط كبير السريرية. المكورات العنقودية الذهبية (S. المذهبة) هي واحدة من الكائنات الدقيقة الأكثر شيوعا معزولة عن زرع المرتبطة الالتهابات. أنها قادرة على إنتاج بيوفيلم التي تغطي أسطح يزرع وربما يؤدي إلى الإصابة 1،2 المقاومة للمضادات الحيوية. علاج العدوى المرتبطة زرع يتطلب في كثير من الأحيان على المدى الطويل في المستشفى لفترات طويلة ومتكررة debridements العلاج بالمضادات الحيوية الوريدية. في الحالات المقاومة للمضادات الحيوية، قد إزالة زرع يكون ضروريا. كما تم المقاومة ارتفاع البكتيريا للمضادات الحيوية المشار إليها من قبل مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC) بأنها "واحدة من المشاكل الصحية في العالم الأكثر إلحاحا." في الوقت المناسب، دون تطوير علاجات المضادة للميكروبات جديدة وفعالة، فمن الممكن أن للأدوية المتعددة العوامل الممرضة المقاومة سيكون غير قابل للعلاج بالمضادات الحيوية التقليدية. منع المرتبط زرعلذا فمن المهم العدوى وهناك حاجة إلى وكلاء وقائية أو رواية نهج لمنع حدوث إصابات من هذا القبيل.

الصفائح الدموية الغنية البلازما (PRP) هو تركيز الدم الذاتي الذي يحتوي عوامل النمو أكثر من 30 التي يمكن أن تساعد مع العظام والتئام العظام الكسب غير المشروع 3-5. وقد تم تطبيق لتعزيز PRP تجديد العظام والأنسجة الناعمة النضج ذكرت على نحو متزايد في العيادات بسبب تركيز عال من عوامل النمو المختلفة الصادرة عن الصفائح الدموية.

خصائص عدة من PRP تشير إلى أن PRP قد يكون لها أيضا خصائص مضادة للميكروبات 6-9. PRP يحتوي على عدد كبير من الصفائح الدموية، على نسبة عالية من الكريات البيضاء (التي قد تكون في حوزتها المضيف الدفاع عن الإجراءات ضد البكتيريا والفطريات)، والببتيدات المضادة للميكروبات متعددة 7،8،10. في دراسة حديثة لفوج كبير من المرضى لعمليات جراحية في القلب، وتبين أن استخدام جراحة داخلية من خلال PRP جل الجرح إغلاق signifانخفض icantly وقوع العدوى القص سطحي وعميق 11. لهذه الأسباب والملاحظات، ونحن افترضنا أن PRP، إلى جانب خصائصه الشفاء تعزيز مدروسة، له خصائص مضادة للميكروبات. قد المزايا المحتملة لاستخدام PRP للوقاية من العدوى ما يلي: (ط) PRP هو أقل عرضة للحث على مقاومة المضادات الحيوية مقارنة مع العلاجات التقليدية. (الثاني) PRP أيضا الخصائص التي التئام الجروح التي قد يكون لها تأثير متناغم على الوقاية من العدوى؛ PRP الشفاء المعززة للخصائص يمكن أن يوفر الختم لمنع التصاق البكتيريا مما يقلل من احتمالات للعدوى والجراثيم والخلايا البشرية تتسابق للأسطح زرع 12 ، 13. (الثالث) هو PRP حيويا بطبيعتها، وآمنة وخالية من خطر الأمراض المعدية.

لدينا على المدى الطويل الهدف من ذلك هو استخدام PRP كنهج جديد لمنع زرع المرتبطة infectiإضافات. كان الهدف من هذه الدراسة هو إعداد PRP باستخدام نهج الطرد المركزي مرتين، لدراسة وPRP في المختبر الخصائص المضادة للميكروبات، ووصف بروتوكولات لتقييم مثل هذه الخصائص المضادة للميكروبات.

Protocol

1. Preparation and Activation of PRP 1.1 Blood draw Anesthetize rabbit by inhalation of isoflurane (2% in O2 for induction and 1% for maintenance). Draw 2 ml 0.129 M tri-sodium citrate (an anticoagulent solution) into a 20 ml syringe. The tri-sodium citrate solution is prepared by dissolving 1.897 g tri-sodium citrate in 50 ml distilled H2O and filtering with a 0.22 μm sterile filter. Sterilize the rabbit ear using 70% ethanol. Dr…

Representative Results

PRP is reproducibly prepared using a twice centrifugation approach (Figure 1). PRP is found to present strong (up to 100-fold reduction in CFUs) in vitro antimicrobial properties against methicillin resistant S. aureus (MRSA) (Figure 3), which is commonly found in hospitals worldwide 14. Similarly, PRP has strong antimicrobial properties against methicillin sensitive S. aureus (MSSA), Group A Streptococcus, and Neisseria gonorrhoeae…

Discussion

Platelet-rich plasma has been increasingly used for clinical applications due to its healing-promoting properties 15-17. In the present study, PRP was presented as a new approach for infection prevention. PRP was found to have strong antimicrobial properties against MRSA, MSSA, Group A Streptococcus, and Neisseria gonorrhoeae. The major advantages of PRP, compared to conventional antibiotic treatments, for infection prevention include: (1) Current antibiotic therapies are facing challenges in…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Therwa Hamza, John E. Tidwell, Nina Clovis, and Suzanne Smith for experimental assistance and Suzanne Smith for proofreading. The authors also thank John Thomas, PhD for providing the bacterial clinical isolates and John B. Barnett, PhD for his support and the use of the biological safety lab at the Department of Microbiology, Immunology and Cell Biology at West Virginia University. The authors acknowledge financial support from the Osteosynthesis and Trauma Care Foundation and National Science Foundation (#1003907). Microscope experiments and image analysis were also performed in the West Virginia University Imaging Facility, which is supported in part by the Mary Babb Randolph Cancer Center and NIH grant P20 RR016440.

Animal use for blood draws were approved by the West Virginia University Institutional Animal Care and Use Committee. All experiments were executed in compliance with all relevant guidelines, regulations, and regulatory agencies.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Bovine thrombin King Pharmaceuticals, Inc 60793-215-05 Thrombin (bovine origin)
Calcium chloride King Pharmaceuticals, Inc 60793-215-05 10% calcium chloride
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Isoflurane Baxter 1001936060
Mueller Hinton broth Becton, Dickinson and Company 275710
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich D8662
Tri-sodium citrate Sigma-Aldrich W302600
Tryptic soy agar Fisher Scientific R01202
Centrifuge Kendro Laboratory Products 750043077
Syringe filter Millipore SLGP033RS
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gristina, A. G. Biomaterial-centered infection: microbial adhesion versus tissue integration. Science. 237, 1588-1595 (1987).
  2. Gristina, A. G., Costerton, J. W. Bacterial adherence to biomaterials and tissue. The significance of its role in clinical sepsis. J. Bone Joint Surg. Am. 67, 264-273 (1985).
  3. Everts, P. A., et al. Reviewing the structural features of autologous platelet-leukocyte gel and suggestions for use in surgery. Eur. Surg. Res. 39, 199-207 (2007).
  4. Marx, R. E. Platelet-rich plasma (PRP): what is PRP and what is not PRP. Implant. Dent. 10, 225-228 (2001).
  5. Toscano, N., Holtzclaw, D. Surgical considerations in the use of platelet-rich plasma. Compend. Contin. Educ. Dent. 29, 182-185 (2008).
  6. Cieslik-Bielecka, A., Gazdzik, T. S., Bielecki, T. M., Cieslik, T. Why the platelet-rich gel has antimicrobial activity?. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 103, 303-306 (2007).
  7. Yeaman, M. R. The role of platelets in antimicrobial host defense. Clin. Infect. Dis. 25, 951-970 (1997).
  8. Tang, Y. Q., Yeaman, M. R., Selsted, M. E. Antimicrobial peptides from human platelets. Infect Immun. 70, 6524-6533 (2002).
  9. El-Sharkawy, H., et al. Platelet-rich plasma: growth factors and pro- and anti-inflammatory properties. J. Periodontol. 78, 661-669 (2007).
  10. Krijgsveld, J., et al. Thrombocidins, microbicidal proteins from human blood platelets, are C-terminal deletion products of CXC chemokines. J. Biol. Chem. 275, 20374-20381 (2000).
  11. Trowbridge, C. C., et al. Use of platelet gel and its effects on infection in cardiac surgery. J. Extra Corpor. Technol. 37, 381-386 (2005).
  12. Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. Infections from biomaterials and implants: a race for the surface. Med. Prog. Technol. 14, 205-224 (1988).
  13. Subbiahdoss, G., Kuijer, R., Grijpma, D. W., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Microbial biofilm growth vs. tissue integration: “the race for the surface” experimentally studied. Acta Biomater. 5, 1399-1404 (2009).
  14. Klevens, R. M., et al. Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States. JAMA. 298, 1763-1771 (2007).
  15. Foster, T. E., Puskas, B. L., Mandelbaum, B. R., Gerhardt, M. B., Rodeo, S. A. Platelet-rich plasma: from basic science to clinical applications. Am. J. Sports Med. 37, 2259-2272 (2009).
  16. Carlson, N. E., Roach, R. B. Platelet-rich plasma: clinical applications in dentistry. J. Am. Dent. Assoc. 133, 1383-1386 (2002).
  17. Man, D., Plosker, H., Winland-Brown, J. E. The use of autologous platelet-rich plasma (platelet gel) and autologous platelet-poor plasma (fibrin glue) in cosmetic surgery. Plast. Reconstr. Surg. 107, 229-237 (2001).
  18. Fridkin, S. K., et al. Epidemiological and microbiological characterization of infections caused by Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to vancomycin, United States, 1997-2001. Clin. Infect. Dis. 36, 429-439 (1997).
  19. Jackson, C. R., Fedorka-Cray, P. J., Davis, J. A., Barrett, J. B., Frye, J. G. Prevalence, species distribution and antimicrobial resistance of enterococci isolated from dogs and cats in the United States. J. Appl. Microbiol. 107, 1269-1278 (2009).
  20. Murray, C. K., et al. Recovery of multidrug-resistant bacteria from combat personnel evacuated from Iraq and Afghanistan at a single military treatment facility. Mil. Med. 174, 598-604 (2009).
  21. Durr, M., Peschel, A. Chemokines meet defensins: the merging concepts of chemoattractants and antimicrobial peptides in host defense. Infect Immun. 70, 6515-6517 (2002).
  22. Hancock, R. E. Peptide antibiotics. Lancet. 349, 418-422 (1997).
  23. Dohan Ehrenfest, D. M., Rasmusson, L., Albrektsson, T. Classification of platelet concentrates: from pure platelet-rich plasma (P-PRP) to leucocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF). Trends Biotechnol. 27, 158-167 (2009).
  24. Kalen, A., Wahlstrom, O., Linder, C. H., Magnusson, P. The content of bone morphogenetic proteins in platelets varies greatly between different platelet donors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 375, 261-264 (2008).
  25. Weibrich, G., Kleis, W. K., Hafner, G., Hitzler, W. E. Growth factor levels in platelet-rich plasma and correlations with donor age, sex, and platelet count. J. Craniomaxillofac. Surg. 30, 97-102 (2002).
  26. Mazzucco, L., Balbo, V., Cattana, E., Guaschino, R., Borzini, P. Not every PRP-gel is born equal. Evaluation of growth factor availability for tissues through four PRP-gel preparations: Fibrinet, RegenPRP-Kit, Plateltex and one manual procedure. Vox Sang. 97, 110-118 (2009).
  27. Lei, H., Gui, L., Xiao, R. The effect of anticoagulants on the quality and biological efficacy of platelet-rich plasma. Clin. Biochem. 42, 1452-1460 (2009).
  28. Redler, L. H., Thompson, S. A., Hsu, S. H., Ahmad, C. S., Levine, W. N. Platelet-rich plasma therapy: a systematic literature review and evidence for clinical use. Phys. Sportsmed. 39, 42-51 (2011).
  29. Whitman, D. H., Berry, R. L., Green, D. M. Platelet gel: an autologous alternative to fibrin glue with applications in oral and maxillofacial surgery. J. Oral Maxillofac. Surg. 55, 1294-1299 (1997).
  30. Anitua, E. Plasma rich in growth factors: preliminary results of use in the preparation of future sites for implants. Int. J. Oral Maxillofac. Implants. 14, 529-535 (1999).
  31. Whitman, D. H., Berry, R. L. A technique for improving the handling of particulate cancellous bone and marrow grafts using platelet gel. J. Oral. Maxillofac. Surg. 56, 1217-1218 (1998).
  32. Currie, L. J., Sharpe, J. R., Martin, R. The use of fibrin glue in skin grafts and tissue-engineered skin replacements: a review. Plast. Reconstr. Surg. 108, 1713-1726 (2001).
  33. Nikulin, A. A. Effect of calcium, thrombin and nucleotides (ADP, cAMP, cGMP) on blood platelet glycolysis and energy metabolism. Farmakol. Toksikol. 43, 585-590 (1980).
  34. Hantgan, R. R., Taylor, R. G., Lewis, J. C. Platelets interact with fibrin only after activation. Blood. 65, 1299-1311 (1985).
  35. Hantgan, R., Fowler, W., Erickson, H., Hermans, J. Fibrin assembly: a comparison of electron microscopic and light scattering results. Thromb. Haemost. 44, 119-124 (1980).
  36. Li, B., Jiang, B., Boyce, B. M., Lindsey, B. A. Multilayer polypeptide nanoscale coatings incorporating IL-12 for the prevention of biomedical device-associated infections. Biomaterials. 30, 2552-2558 (2009).
  37. Li, B., Jiang, B., Dietz, M. J., Smith, E. S., Clovis, N. B., Rao, K. M. K. Evaluation of local MCP-1 and IL-12 nanocoatings for infection prevention in open fractures. J. Orthop. Res. 28, 48-54 (2010).
  38. Boyce, B. M., Lindsey, B. A., Clovis, N. B., Smith, E. S., Hobbs, G. R., Hubbard, D. F., Emery, S. E., Barnett, J. B., Li, B. Additive effects of exogenous IL-12 supplementation and antibiotic treatment in infection prophylaxis. J. Orthop. Res. 30 (2), 196-202 (2012).

Tags

Platelet-rich Plasma (PRP)Antimicrobial PropertiesImplant-associated InfectionAntibiotic ResistanceOrthopaedic InfectionsMethicillin-sensitive Staphylococcus AureusMethicillin-resistant Staphylococcus AureusGroup A StreptococcusNeisseria GonorrhoeaeInfection PreventionIn Vitro Antimicrobial ActivityBiocompatibleTwice Centrifugation Approach

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Li, H., Li, B. PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP. J. Vis. Exp. (74), e50351, doi:10.3791/50351 (2013).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image