Separação de<em> Plasmodium falciparum</em> Fase Tardia eritrócitos infectados por meio magnético
Summary
As propriedades paramagnéticas de hemozoin são utilizados para isolar as fases tardias da<em> Plasmodium falciparum</em>-Infectadas células vermelhas do sangue que crescem em cultura. O método é simples e rápido e não afeta as capacidades subseqüentes invasoras dos parasitas.
Abstract
Ao contrário de outras espécies de Plasmodium, P. falciparum pode ser cultivado no laboratório, o que facilita o seu estudo 1. Enquanto a parasitemia obtida pode atingir o limite ≈ 40%, o investigador geralmente mantém a percentagem de cerca de 10%. Em muitos casos, é necessário isolar o parasita contendo glóbulos vermelhos (RBC) de os não infectados, para enriquecer a cultura e proceder com uma dada experiência.
Quando P. falciparum infecta o eritrócito, o parasita se degrada e se alimenta de hemoglobina 2, 3. No entanto, o parasita tem de lidar com uma porção heme muito tóxico contendo ferro 4, 5. O parasita escapa a sua toxicidade mediante a transformação do heme em um polímero de cristal inerte chamado haemozoin 6, 7. Esta molécula contendo ferro é armazenado no seu vacúolo alimentar e o metal em que tem um estado de oxidação diferente daquele do heme 8. O estado férrico em ferro no hemeozoin confere-lhe uma propriedade paramagnética ausente em eritrócitos não infectados. À medida que o parasita invasor atinge a maturidade, o conteúdo de haemozoin também aumenta 9, que confere paramagnetismo ainda mais sobre as últimas fases de P. falciparum no interior de eritrócitos.
Com base nesta propriedade paramagnético, os últimos estágios de P. As células infectadas falciparum-vermelhos do sangue podem ser separados pela passagem da cultura através de uma coluna contendo as esferas magnéticas. Estes grânulos tornar magnético quando as colunas que contêm eles são colocados sobre um suporte de íman. RBC infectados, devido à sua paramagnetismo, será então aprisionado no interior da coluna, enquanto que o fluxo através conterá, na sua maior parte, os eritrócitos não infectados e os estágios iniciais da contendo o parasita.
Aqui, descrevemos a metodologia para enriquecer a população de parasitas estágio final com colunas magnéticas, que mantém a viabilidade do parasita bom 10.Depois de executar este processo, a cultura não acoplada pode ser retornado para uma incubadora para permitir que as restantes parasitas que continue a crescer.
Protocol
Representative Results
Discussion
As culturas in vitro de parasita da malária P. falciparum exibem uma parasitemia limitada, com mais de metade das células vermelhas do sangue não infectados, no ponto mais elevado de proliferação de cultura. Para a maioria das experiências de investigação, é desejável para funcionar apenas com os eritrócitos infectados. Para este fim, uma técnica de separação é necessário dividir a cultura de acordo com a infecção. Métodos úteis incluem a utilização de estreptolisina para…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por subvenções PRB-009 para o CS e uma bolsa de doutorado à LC, do Nacional Secretaría de Ciencia y Tecnología (SENACYT), Panamá.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| RPMI 1640 Hepes Modified | Sigma-Aldrich | R4130 | Supplemented with 10% human serum, 2% glucose, and 0.2% sodium bicarbonate |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Columns | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Hemacytometer | Grafco | Grafco Neubauer Chamber | Can be found through many other suppliers |
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