Scheiding van<em> Plasmodium falciparum</em> Late Stage-geïnfecteerde erythrocyten met magnetische middelen
Summary
De paramagnetische eigenschappen van hemozoin gebruikt in latere stadia van isolaat<em> Plasmodium falciparum</em>-Geïnfecteerde rode bloedcellen groeien in cultuur. De methode is eenvoudig en snel en heeft geen invloed op de latere invasieve mogelijkheden van de parasieten.
Abstract
In tegenstelling tot andere soorten Plasmodium, P. falciparum kunnen worden gekweekt in het laboratorium, dat de studie 1 vergemakkelijkt. Terwijl de behaalde parasitemie bereikt u de ≈ 40%-grens, de onderzoeker houdt meestal het percentage op ongeveer 10%. In veel gevallen moet de parasiet bevattende rode bloedcellen (RBC's) van de geïnfecteerde die, isoleren de te verrijken met een bepaald experiment gaan.
Toen P. falciparum infecteert de erytrocyten, de parasiet degradeert en voert uit hemoglobine 2, 3. Wel moet de parasiet maken met een zeer giftige ijzerhoudende haem groep 4, 5. De parasiet ontsnapt toxiciteit door het transformeren van de haem in een inert kristalpolymeer genoemd haemozoin 6, 7. Dit ijzerhoudende molecule opgeslagen in de vacuole voedsel en metaal in een oxidatieve toestand heeft die verschilt van die in haem 8. De ferri toestand van ijzer in de haemozoin haar een paramagnetische eigenschap afwezig is in niet-geïnfecteerde erythrocyten. Als de binnenvallende parasiet volwassen is, de inhoud van haemozoin verhoogt ook 9, die nog meer paramagnetisme schenkt de laatste stadia van de P. falciparum in de erytrocyt.
Op basis van deze paramagnetische eigendom, de laatste stadia van de P. falciparum geïnfecteerde rode bloedcellen worden gescheiden door het passeren van de cultuur door een kolom met magnetische korrels. Deze kralen magnetisch worden wanneer de kolommen met hen op een magneethouder. Geïnfecteerde erytrocyten, vanwege hun paramagnetisme, wordt dan ingesloten in de kolom, terwijl de doorstroom bevat, voor het grootste deel, geïnfecteerde erytrocyten en die welke vroege stadia van de parasiet.
Hier beschrijven we de methodologie voor de bevolking van laat stadium parasieten verrijken met magnetische kolommen, die een goede parasiet levensvatbaarheid 10 onderhoudt.Nadat deze procedure kan de losse cultuur worden teruggestuurd naar een incubator om de resterende parasieten blijven groeien.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vitro culturen van de malariaparasiet P. falciparum vertonen een beperkte parasitemie, meer dan de helft van de geïnfecteerde rode bloedcellen op het hoogste punt van proliferatie cultuur. Voor de meeste onderzoek experimenten is het wenselijk om alleen met de geïnfecteerde erythrocyten. Daartoe een scheidingstechniek moet de cultuur splitsen naar infectie. Bruikbare methoden omvatten het gebruik van streptolysine O te permeabiliseren en Lyze de geïnfecteerde RBC 11 en een reeks variat…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door subsidie PRB-009 CS en een doctoraatsbeurs naar LC, van de Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología (SENACYT), Panama.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| RPMI 1640 Hepes Modified | Sigma-Aldrich | R4130 | Supplemented with 10% human serum, 2% glucose, and 0.2% sodium bicarbonate |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Columns | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Hemacytometer | Grafco | Grafco Neubauer Chamber | Can be found through many other suppliers |
References
- Jensen, J. B., Trager, W. Plasmodium falciparum in culture: use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method. J. Parasitology. 63 (5), 883-886 (1977).
- Guzman, I. Y., Francis, S. E., Oksman, A., Smith, C. E., Duffin, K. L., Goldberg, D. E. Order and specificity of the Plasmodium falciparum hemoglobin degradation pathway. J. Clin. Invest. 93, 1602-1608 (1994).
- Rosenthal, P. J., Meshnick, S. R. Hemoglobin catabolism and iron utilization by malaria parasites. Mol. Biochem. Parasitol. 83 (2), 131-139 (1996).
- Fitch, C. D., Chevli, R., Kanjananggulpan, P., Dutta, P., Chevli, K., Chou, A. C. Intracellular ferriprotoporphyrin IX is a lytic agent. Blood. 62 (6), 1165-1168 (1983).
- Hebbel, R. P., Eaton, J. W. Pathobiology of heme interaction with the erythrocyte membrane. Semin. Hematol. 26 (2), 136-149 (1989).
- Egan, T. J. Haemozoin formation. Mol. Biochem. Parasitol. 157 (2), 127-136 (2008).
- Hempelmann, E., Marques, H. M. Analysis of malaria pigment from Plasmodium falciparum. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 32 (1), 25-30 (1994).
- Fitch, C. D., Kanjananggulpan, P. The state of ferriprotoporphyrin IX in malaria pigment. J. Biol. Chem. 262 (32), 15552-15555 (1987).
- Moore, L. R., Fujioka, H., Williams, P. S., Chalmers, J. J., Grimberg, B., Zimmerman, P. A., Zborowski, M. Hemoglobin degradation in malaria-infected erythrocytes determined from live cell magnetophoresis. FASEB J. 20 (6), 747-749 (2006).
- Spadafora, C., Gerena, L., Kopydlowski, K. M. Comparison of the in vitro invasive capabilities of Plasmodium falciparum schizonts isolated by Percoll gradient or using magnetic based separation. Malaria J. 10, 96 (2011).
- Jackson, K. E., Spielmann, T., Hanssen, E., Adisa, A., Separovic, F., Dixon, M. W., Trenholme, K. R., Hawthorne, P. L., Gardiner, D. L., Gilberger, T., Tilley, L. Selective permeabilization of the host cell membrane of Plasmodium falciparum-infected red blood cells with streptolysin O and equinatoxin II. Biochem. J. 403, 167-175 (2007).
- Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation. Ann. Trop. Med. Parasitol. 88 (2), 209-211 (1994).
- Pasvol, G., Wilson, R. J., Smalley, M. E., Brown, J. Separation of viable schizont-infected red cells of Plasmodium falciparum from human blood. Ann. Trop. Med. Parasitol. 72, 87-88 (1978).
- Pertoft, H. Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll. J. Biochem. Biophys. Methods. 44 (1-2), 1-30 (2000).
- Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. The Lancet. 318, 70-71 (1981).
- Trang, D. T., Huy, N. T., Kariu, T., Tajima, K., Kamei, K. One-step concentration of malarial parasite-infected red blood cells and removal of contaminating white blood cells. Malar. J. 3, 7 (2004).
- Nillni, E. A., Londner, M. V., Spira, D. T. A simple method for separation of uninfected erythrocytes from those infected with Plasmodium berghei and for isolation of artificially released parasites. Z. Parasitenkd. 64, 279-284 (1981).
