ゼブラフィッシュを用いた病的ヒトゲノムの in vivoモデルで

劣性とPseudorecessive障害一次繊毛は、増殖、極性、分化、組織の維持を含め、複数の細胞運命の細胞シグナルの役割を果たしている脊椎動物のボディプランに近いユビキタス構造です。これらのオルガネラの5機能障害は、人間の遺伝性疾患の広い範囲につながると総称ciliopathies。6,7つのそのような臨床実体はバーデット-ビードル症候群（BBS）、網膜変性、肥満、性腺機能低下症、多指症、および腎機能障害によって特徴づけ多臓器小児疾患である。7アレル病原性のin vivoアッセイの開発が必要であったBBSので）、それは、少なくとも17の遺伝子7-10で発生主として民間非同義変化によって引き起こされる遺伝的異質性疾患であり、BBSファミリーの> 25％のB）oligogenic継承、第二のヘテロ接合体の変化の存在を特徴とBBS遺伝子（劣性プライマリー因果変異に加えて）臨床浸透度と表現力を調節することができる。通常、このような第三の対立は、このようにタンパク質の機能に及ぼす生物学的効果の正確な解釈を必要とする遺伝的観点、不明確病原電位からの非同義ヘテロ接合変化、である。11-13 アルマ – BBSにおける突然変異負荷に貢献する変異の病原性の可能性を調べるために、我々は、最初はBBS1で識別されるすべてのミスセンスの変更をテストした。我々と他の人の両方が基礎体温タンパク質の損失は平面内細胞極性の調節不全（PCP、非カノニカルWntシグナル伝達）を生じさせることが示されている。半ば体節ゼブラフィッシュ胚における収束拡張欠陥として顕在14この生理学的に関連する表現型の読み出しを使用して、我BBS遺伝子の抑制を短縮体軸、広く、薄く体節、広帯域、よじれnotochordsをもたらすことを見出した。15 <にSUP />（図2）MO-による抑制は、原腸形成の欠陥を生産、およびin vivoの方法で別の 3で得点に人間のmRNAと同時注射（と再現）著しくこれらの表現型を救出した。まず、胚は質的表現型基準（ノーマル、クラスIおよびクラスII、表現型のクラスの詳細な定義については、15を参照）によると、ライブスコア化した。次に、遊走細胞を可視化するフルオレセイントレーサーを用いることにより、被包中の細胞遊走を（卵黄セル16の上にセル層の薄層化と拡散することを特徴と早期発達段階）定量。最後に、我々は平らな形態素解析のためにマウントされたkrox20、PAX2とMyoDのリボプローブのカクテル、とハイブリダイズin situで九体節胚において体節トランクの長さを測定した。 この方法は、毛様体変異空間における対立遺伝子の過剰500でテストするために使用されている。いずれかで一人で勉強し、> 130対立遺伝子のin vivo試験では表現型のスコアの範囲を生産し、完全な、良性に分類された（図1）我々のプロトコルによって救出示さ（WT救助大きく異なっていない）、部分的には、（大幅に改善hypomorphsとして分類された救助）WT救助よりMOからではなく、より深刻な、救助に失敗は、機能ヌル（MO大きく異なっていない）、そして支配的なネガに分類されたMOに比べて単独の変異体mRNAによって誘発表現型として分類された。 また、ゼブラフィッシュにおけるin vivo相補アッセイの感度および特異性を評価した。特異性は、共注入共通のSNP（健康な対照集団における> 5％のマイナーアレル頻度）により確認したが、これらを14/17（> 82％）を試験に良性の表現型を与えることが見出され、示されるように、感度は98％であることが示された生体データと遺伝引数十分T 中の間に一致によりoはBBS血統で因果として対立遺伝子を属性17に加えて、表現型効果がイムノと細胞内局在研究を用いたin vivoの措置（ライブスコア、被包トラッキング、ISH形態計測）in vitroで検証された3つを用いて観察。これらの結果の解釈は病気の病因の少なくとも一つのメカニズム予備知識を必要としますが、この例では、我々のプロトコルの有用性と堅牢性を立証するための証拠を提供しています。我々は公平な突然変異スクリーニングとTTC21B、逆行性鞭毛内輸送タンパク質の機能解析研究における実験的証拠の複数の他のラインとの生体内のスコアを裏付け以来持っている。18 支配的な障害肢帯筋ジストロフィー（LGMD）は腰と肩が遅い進行筋力低下を引き起こし、筋ジストロフィーの常染色体クラスである。この遺伝的にと私chanistically疾患の異質グループは、複数の、筋細胞膜サルコメア、細胞質、核タンパク質全体で優性と劣性変異の両方によって引き起こされる。臨床表現型と磁気共鳴画像から筋肉の関与の証拠の提示に基づいて、我々は、フィンランド、米国、イタリアの家族19で見つかった支配LGMDの原因を調査した。マッピングされた遺伝子座内の位置候補の配列がDNAJB6の変異を明らかにし、HSP70ファミリーの共同シャペロンをコードする遺伝子は、ヒトの少なくとも二つのスプライスアイソフォーム（核および細胞質）として表現。 DNAJB6機能とLGMDとの関連性にさらなる洞察を得るために、我々は、ゼブラフィッシュの筋肉の整合性におけるその役割を検討した。ゼブラフィッシュオルソログ（dnajb6b）のRT-PCRは、スプライスブロッキングモルホリノと胚の注入が続いた五体節期、早けれ式を検出しました。 48時間後の受精では、マスクされたスコアは、低速の剥離が認められた彼らの挿入ポイントからの繊維。この表現の特異性は、その後、第二の非重複MOでテストされ、WT人間DNAJB6 mRNAとその後救助された。 DNAJB6機能の喪失が筋肉の整合性の欠陥につながるどのように照会するには、我々は両方のアイソフォームのヒト転写に患者に見られるミスセンス変異を導入し、ゼブラフィッシュ胚にそれらを注入した。 WT人間のmRNAの注射は目立った表現型を生成しませんが、これらの変化は、細胞質に設計MOの機能効果の損失をphenocopiedが、核ではないアイソフォーム。これは、支配的な影響を示唆して、筋肉の表現型の強化された重大度を示し、変異体およびWT mRNAを、等モル量の同時注入が続いた。この概念をテストするために、さらなる注射は変異体およびWT mRNAのモル比を変えることにより行なった。予測と一致して、変異体mRNAの過剰は、胚におけるWT誘導し致死率と比較しながらWTのn過剰は次第に増加して救助を生産。これは、oligimerization特性および可能なタンパク質相互作用を決定するインビトロ実験を行った。 LOF BAG3での小児科のフォームを引き起こすので、これらは、変異が細胞質DNAJB6のantiaggregation活動を損なうともLGMDの病理学的機序に関連する変異体およびWT両方の売上高だけでなく、他の分子と相互作用し、BAG3、に干渉することを示した筋ジストロフィー20。我々はその後BAG3がゼブラフィッシュにおける変異DNAJB6bによって誘発表現型を調節することができるかどうか尋ねました。 WT BAG3の注入だけではなく表現型を生成しませんが、DNAJB6変異との混注を大幅BAG3は、このような変異体19の病原を媒介する役割を果たしていることを示唆し、表現型の重症度を増加させた。 過渡ゼブラフィッシュモデル <TD> 変異ゼブラフィッシュライン トランスジェニックマウスライン 調査中の人間の表現型の発症年齢 出生前の新生児の小児科の出生前の新生児の小児科の出生前の新生児の小児科の成人 実現可能な表現型 頭顔の筋肉のシグナル伝達心臓の腎臓の血管の頭顔の筋肉のシグナル伝達心臓の腎臓の血管の頭顔の筋肉のシグナル伝達心臓の腎臓の血管の感覚の骨格内臓の行動の呼吸器の生殖の内分泌代謝の 使用するまでの時間 （誕生から） 1-7日 > 3ヶ月 > 6ヶ月 スループット 中高低い低い メリット 特定の変異をテストする能力ノックインモデルを生成する能力モルホリノノックダウンを使用する能力低コストのメンテナンス少ない実験的ばらつきクローサー進化的関係臓器構造の保全遺伝子と能力率はノックインモデル 表1。 in vivoモデルの比較 。 表2。人間dysmorphologiesのin vivoモデルでの例。様々な表現型は、提示されたプロトコルの下でテスト。表現型の読み出しと可視化技術の範囲は、障害の種類に基づいて採用することができる。 大きいテーブルを表示するには、ここをクリックしてください。 図1非同義変異型のin vivo機能テストで 。すべての機能テストへの体系的なアプローチ不明または仮説意義eles。モルホリノマイクロインジェクション経由遺伝子ノックダウンは、WTおよび変異ヒトmRNAの両方の（共）注射のシリーズが続いている。表現型の結果の統計的分析は、対立遺伝子の病原性と分子機能に通知します。簡単に言えば、 機能検査の損失：ノックダウン変異体およびWTのmRNAによって同等に救出することができた表現型を生成する場合、対立遺伝子は（緑のボックス）おそらく良性です。ノックダウンの表現型の変異救助ノックダウン表現型と区別がつかない場合は、対立遺伝子は、おそらく機能ヌル（黄色の箱）です。ノックダウンの表現型の変異救助MOよりも統計的に良いですが、WTよりも悪い場合は、対立遺伝子は、おそらく低次形態（緑のボックス）が支配的な試験のために：。変異mRNAの注入は、野生型mRNAのと同等である場合、対立遺伝子は、良性または機能の喪失のいずれであってもよい、またはアッセイは（緑のボックス）が失敗した可能性があります。変異体mRNAの注入はindisである場合 MOノックダウンからtinguishable、遺伝子産物の機能は、おそらく何らかの方法で変更される。機能の変化を識別する、野生型mRNAと変異型のmRNAを滴定する。この滴定の結果は、単独で、野生型mRNAに区別できない場合には、変異タンパク質産物は、それによってドミナントネガティブの形質を（青箱）を示す、基質として野生型タンパク質を使用する。この滴定の結果は単独変異体mRNAに区別できない場合には、変異タンパク質産物は、もはや、野生型と同じ機能を持っていないので、おそらく機能（青箱）の利得である。まだ表現型はMOノックダウンから提示ないが、WT mRNAを、本行い 、さらなる実験が発生することができれば、WTヒトmRNAは、表現型を最小化するために滴定されるべきであり、また、新たな設定点として使用することができる。 WTおよび変異ヒトmRNAの更なる同時注入は変異（ピンク箱）の救出能力に基づいて評価することができます。ら= "_blank">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。 図2。ヒトで検出さMKS1変異の定量的および定性的評価。mks1 morphant胚の発達の欠陥。重大度に基づいて、表現型は3つのグループに分類した。各クラスの例としては、（）が示されており、その胚集団内での有病率（nは= 100-160胚）（図示せず）を集計した。クラスとMO注入胚は私の表現型は肉眼正常な形態を持っていたが、同じ体節年齢（8-9体節）で注入胚を対照と比較して卵黄に過度の胚組織で、短かった。クラスII morphantsは、薄く短く、不十分頭と尾の構造を開発し、さらに、体節の定義を欠いていたと対称性。クラスIII胚は厳しく、未発達と不格好な体節で遅れnotochordsを波状、通常は10体節の段階を過ぎて生存しなかった。人間MKS1 mRNAの同時注射はmks1抑制に表現型の特異性を実証し、これらの欠陥のそれぞれを救出。krox20、PAX2とMyoDのリボプローブで染色し、11体節段階（±1体節）での胚のin situハイブリダイゼーション（A、B、C ）。表現型は、Cで定量最初から各胚の最後のかなりの体節（矢印）に測定することによって定量した。図15から許可を得て適応した。 図3。人間の異形学のin vivoモデルでの例。 （a）は顔面異形学。 mRNAを注入された胚（左）と5 DPFでアルシアンブルーで染色した変異体、注入胚（右）を制御します。変異mRNAを注入胚は鰓弓と欠落しているか、不正な形式の構造をスプレイ含む軟骨頭蓋顔面骨格の一般的な解体と、特に小さいと不格好な頭を表示します（B）マイクロ/大頭。制御は5 DPFで胚（左）とkctd13 MO注入胚（右）を非注入。 Morphants目の間のスペースで見られるように、頭の拡大表示します21（c）は、血管の完全性を減少させた。コントロールは、胚を非注入（上）とENG MO注入胚（下）FLI1 2 DPFで蛍光顕微鏡を用いて画像化：のeGFPトランスジェニックレポーターライン。節間血管や他の血管構造の出芽障害Morphantsが表示。41（d）に改変された心臓のループを。ユニのin situハイブリダイゼーションccdc39 morphant胚（図示せず）が二国間の示した（右）または、ほとんどの場合、検出不可能なSPAW式ながらnjected野生型胚（左）は、左側の側板中胚葉におけるSPAWの発現を示す図43（e）の腎嚢胞が。非注入WT胚（上）とift80 morphant（下）。 Morphantsは大きな腎嚢胞（矢印）、心膜水腫（矢じり）とカールテールを表示しました。44（f）に削減糸球体ろ過。制御注入胚（上）とift80 morphant（下）心にローダミンデキストランの注入後24時間の蛍光可視化。血管系全体に蛍光分散し、コントロールの蛍光の完全な欠如が見られるようにほぼ完全に腎臓によって排出される。 morphantは減少、糸球体濾過を示唆している永続的な蛍光デキストランが表示されます46（g）の筋ジストロフィー。 WT DNAJB6はmRNA注入された胚は（上）抗遅いミオシン抗体を用いた免疫染色によって決定されるように隣接myosepta間で正常に体節にまたがる正常遅い筋線維を示す。ミュータントDNAJBb（下）は、1つまたは複数の体節にmyoseptaから筋繊維の剥離を完了する部分を示した図19（h）に体節角度。コントロール非注入（上）または30 HPFで撮像kif7 morphants（下）のライブ横ビューを拡大。 Morphantsは、ゼブラフィッシュの筋節内シグナリング異所ヘッジホッグに帰属異常形の体節を、表示します47 すべての数字は、許可を得て適応。