En Vivo Modelado del Genoma Humano Morbid usando Danio rerio

Trastornos recesivos y Pseudorecessive Cilios primarios son estructuras casi ubicuos en el plan del cuerpo vertebrado que desempeñan papeles de señalización celular en múltiples destinos celulares, incluyendo la proliferación, la polaridad, la diferenciación y mantenimiento de los tejidos. 5 La disfunción de estos orgánulos conduce a una amplia gama de trastornos genéticos humanos que se refiere colectivamente como ciliopatías. 6,7 Uno de tales entidad clínica es el síndrome de Bardet-Biedl (BBS), un trastorno pediátrica multisistémica caracterizada por degeneración de la retina, la obesidad, hipogonadismo, polidactilia, y disfunción renal. 7 El desarrollo de ensayos in vivo de patogenicidad alelo fue necesario para BBS porque a) es un trastorno genéticamente heterogéneo causada principalmente por cambios privados no sinónimas ocurren en al menos 17 genes 7-10, y b) la herencia oligogenic en> 25% de las familias del BBS, en el que la presencia de cambios heterocigotos en un segundoBBS gen (además de las mutaciones causales primarios recesivos) puede modular la penetrancia clínica y expresividad. Por lo general, estas terceras alelos son nonsynonymous cambios heterocigotos de, desde un punto de vista genético, el potencial patogénico poco claro, por lo que necesitarán una interpretación precisa de sus efectos biológicos en función de las proteínas. 11-13 Para investigar el potencial patogénico de las mutaciones que contribuyen a la carga mutacional en BBS, inicialmente a prueba todos los cambios missense identificadas en BBS1 – BBS14. Tanto nosotros y otros han demostrado que la pérdida de proteínas basal del cuerpo da lugar a la desregulación de la polaridad celular plana (PCP; señalización de Wnt no canónica). Manifestándose como defectos convergentes de extensión en embriones de pez cebra mediados de somíticos 14 El uso de este lectura fenotípica fisiológicamente relevante, nos han encontrado que la supresión de los genes BBS resultó en ejes acortadas del cuerpo, somitas más amplias y más delgado, y de ancho, notochords retorcidas. 15 </Sup> (Figura 2) de supresión de MO-inducida producido defectos gastrulación, y co-inyección con ARNm humano rescatado significativamente (y reproducible) estos fenotipos como anotado por tres diferentes métodos in vivo. En primer lugar, los embriones fueron anotados viva de acuerdo con criterios fenotípicos cualitativos (Normal, Clase I y Clase II, para las definiciones detalladas de las clases fenotípicas ver 15). A continuación, su cuantificación migración celular durante epibolia (una etapa de desarrollo temprano que se caracteriza por el adelgazamiento y la difusión de las capas de células sobre la celda yema 16) mediante el empleo de un trazador de fluoresceína para visualizar las células que migran. Por último, se midió la longitud del tronco somite en embriones de nueve somite hibridadas in situ con un cóctel de Krox20, pax2 y ribosondas MyoD, que se han montado plana para el análisis morfológico. Esta metodología se ha utilizado para probar en exceso de 500 alelos en el espacio mutacional ciliar. En unoestudiar solo, las pruebas in vivo de> 130 alelos en producido un rango de puntuaciones fenotípicas; como se indica por nuestro protocolo (Figura 1) completa rescates fueron clasificados como benignos (no significativamente diferente de WT rescate), parcial rescata fueron clasificados como hypomorphs (mejorado significativamente de MO, pero más grave que la WT rescate), la falta de rescate se clasificaron como nulo funcional (no significativamente diferente de MO), y los fenotipos inducidos por el mutante ARNm solos en comparación con MO fueron clasificados como dominantes negativos. También hemos evaluado la sensibilidad y especificidad del ensayo de complementación in vivo en el pez cebra en. La especificidad fue confirmada por co-inyección de SNPs frecuentes (> 5% alelo menor frecuencia en las poblaciones sanas de control), los cuales se encontraron para dar fenotipos benignos en 14/17 prueba (> 82%), y la sensibilidad ha demostrado ser 98%, como se indica por la concordancia entre los datos in vivo y argumentos genéticos suficientes camisetaso atribuir un alelo como causal en un BBS pedigrí. 17 Además, los efectos fenotípicos observados utilizando los tres en medidas in vivo (puntuación en vivo, el seguimiento de epibolia, e ISH morfometría) fueron validados in vitro utilizando inmunotransferencia y estudios de localización celular. Si bien la interpretación de estos resultados requiere conocimiento previo de al menos uno de los mecanismos de la patogénesis de la enfermedad, este ejemplo proporciona pruebas para justificar la utilidad y solidez de nuestro protocolo. Hemos corroborado desde nuestra puntuación en vivo con varias otras líneas de evidencia experimental en la investigación y el estudio mutacional imparcial análisis funcional de TTC21B, una proteína de transporte intraflagellar retrógrada. 18 Trastornos dominantes Distrofias musculares faja (LGMD) son una clase autosómica de distrofia muscular, que causa debilidad muscular progresiva lenta en las caderas y los hombros. Este genéticamente y mechanistically grupo heterogéneo de enfermedades es causada por dos mutaciones dominantes y recesivos a través del sarcolema múltiple, sarcoméricos, citoplasma y proteínas nucleares. Basado en la presentación de los fenotipos clínicos y la evidencia de afectación de los músculos de la resonancia magnética, se determinó la causa de la LGMD dominante se encuentra en Finlandia, EE.UU., y 19 familias italianas. La secuenciación de los candidatos posicionales en el locus asignada reveló mutaciones en DNAJB6, un gen que codifica un co-chaperona de la familia HSP70 expresa como al menos dos isoformas de empalme (nuclear y citoplásmica) en los seres humanos. Para obtener más conocimientos sobre DNAJB6 función y su importancia para la LGMD, hemos examinado su papel en la integridad muscular en el pez cebra. RT-PCR de la ortólogo de pez cebra (dnajb6b) detectó la expresión tan pronto como la etapa de cinco somite, que fue seguido por la inyección de embriones con un empalme morfolino-bloqueo. A las 48 h después de la fertilización, la puntuación enmascarado mostró desprendimiento lentofibras de sus puntos de inserción. La especificidad de este fenotipo fue probado con una segunda MO que no se superponen y rescatado posteriormente con WT DNAJB6 ARNm humano. Para consultar cómo la pérdida de función DNAJB6 conduce a defectos en la integridad muscular, hemos introducido mutaciones sin sentido que se encuentran en los pacientes en transcripciones humanos de ambas isoformas y las inyectaron en embriones de pez cebra. Mientras que la inyección de ARNm humano WT no produjo ningún fenotipo apreciable, estos cambios phenocopied la pérdida de función de los efectos de la MO cuando diseñado en el citoplasma, pero no isoforma nuclear. Esto fue seguido por co-inyección de cantidades equimolares de ARNm mutante y WT, que mostró una mayor severidad del fenotipo muscular, lo que sugiere un efecto dominante. Para probar esta idea, más inyecciones se llevaron a cabo con la alteración de las relaciones molares de ARNm mutante y el WT. De acuerdo con la predicción, un exceso de ARNm mutante en comparación con la letalidad inducida WT en los embriones, mientras que unn superior a WT produce un aumento progresivo de rescate. Esto fue seguido por los experimentos in vitro para determinar las propiedades oligimerization y las posibles interacciones de proteínas. Estos mostraron que las mutaciones alteran la actividad antiagregación de DNAJB6 citoplasmática e interfieren con la rotación de ambos mutantes y WT, así como interactuar con otra molécula, BAG3, que también es relevante para el mecanismo patógeno de la LGMD, desde LOF BAG3 causa una forma pediátrica de distrofia muscular 20. A continuación pregunta si BAG3 podría modular el fenotipo inducido por DNAJB6b mutante en el pez cebra. Mientras que la inyección de WT BAG3 sola produjo ningún fenotipo, coinyección con DNAJB6 mutantes aumentado de manera significativa la gravedad fenotípica, lo que sugiere que BAG3 juega un papel en la mediación de la patogenicidad de tales mutantes 19. Modelo de pez cebra transitoria <td> pez cebra mutante Line Ratones transgénicos Line La edad de aparición del fenotipo humano bajo investigación prenatal neonatal pediátrico prenatal neonatal pediátrico prenatal neonatal pediátrico adulto Fenotipos viables craneofacial muscular señalización cardíaco renal vascular craneofacial muscular señalización cardíaco renal vascular craneofacial muscular señalización cardíaco renal vascular sensorio esquelético visceral conductual respiratorio reproductivo endocrino metabólico Tiempo hasta su uso (desde el nacimiento) 1-7 días > 3 meses > 6 meses Rendimiento medio-alto bajo bajo Ventajas Capacidad para probar mutaciones específicas Capacidad de generar modelos knock-en Capacidad para utilizar caídas morpholino Mantenimiento de bajo costo Menos variabilidad experimental Estrecha relación evolutiva Conservación de las estructuras de órganos Capacidad de gentasa de rebote en los modelos Tabla 1. Comparación de modelos in vivo. Tabla 2. Ejemplos de modelos en vivo de dysmorphologies humanos. Varios fenotipos probados en el protocolo presentado. Una serie de lecturas fenotípicas y técnicas de visualización se puede emplear en función del tipo de trastorno. Haga clic aquí para ver la tabla más grande. Figura 1. En las pruebas funcionales in vivo de las variantes no sinónimas. Un enfoque sistemático para la prueba de funcionamiento de todas laseles de significado desconocido o hipótesis. Gen desmontables a través de morfolino microinyección es seguido por una serie de (co) inyecciones de ambos WT y ARNm humano mutante. Los análisis estadísticos de los resultados fenotípicos informar a la patogenicidad alelo y la función molecular. En pocas palabras, la pérdida de las pruebas de función: Si la caída produce un fenotipo que puede ser rescatado por igual las mRNA mutantes y WT, el alelo probablemente benigna (caja verde). Si el rescate del fenotipo mutante caída es indistinguible de la desmontables fenotipo, el alelo es un nulo funcional probable (caja amarilla). Si el rescate del fenotipo mutante caída es estadísticamente mejor que el MO, pero peor que el WT, es probable que el alelo de un hypomorph (caja verde) Para las pruebas dominantes:. Si la inyección de ARNm mutante es equivalente a la de los de tipo salvaje ARNm , el alelo puede ser benignos o pérdida de la función, o el ensayo puede haber fallado (caja verde). Si la inyección de ARNm mutante es indis distinguible de MO desmontables, la función del producto del gen se altera probablemente de algún modo. Para discernir el cambio en la función, se valorarán ARNm mutante de tipo salvaje ARNm. Si el resultado de esta valoración es indistinguible de tipo salvaje ARNm solos, el producto de proteína mutante utiliza la proteína de tipo salvaje como sustrato, indicando de este modo un fenotipo dominante negativo (caja azul). Si el resultado de esta valoración es indistinguible de ARNm mutante solo, el producto de la proteína mutante ya no tiene la misma función que la de tipo salvaje, y por lo tanto es probable que una ganancia de función (caja azul). Si no hay ningún fenotipo presenta de MO desmontables, pero lo hace presente con ARNm WT, puede ocurrir la experimentación adicional, WT ARNm humano debe ajustarse para minimizar el fenotipo, y también se puede utilizar como un nuevo punto de ajuste. Además coinyección de WT y mutante ARNm humano puede ser evaluada sobre la base de la capacidad de rescate de la mutante (caja de color rosa).et = "_blank"> Haga clic aquí para ver más grande la figura. Figura 2. La evaluación cuantitativa y cualitativa de MKS1 mutaciones detectadas en los seres humanos. Defectos del desarrollo en embriones MKS1 morphant. En base a la gravedad, los fenotipos se clasifican en tres grupos. Se muestran ejemplos de cada clase (a), y su prevalencia dentro de su cohorte de embriones (n = 100-160 embriones) fueron tabulados (no se muestra). MO inyectado embriones con Clase I fenotipos tenían groseramente morfología normal, pero eran más cortos, con tejido embrionario excesiva en la yema de huevo en comparación con el control de embriones inyectados a la misma edad somitic somitas (8-9). Morphants Clase II se adelgazan, corto y poco habían desarrollado estructuras de cabeza y la cola, y, además, carecían de definición somiticy la simetría. Embriones clase III fueron severamente retrasados ​​somitas poco desarrollados y deforme, onduladas notochords, y por lo general no sobreviven más allá de la etapa 10-somite. Co-inyección de MKS1 ARNm humano rescatado cada uno de estos defectos, que demuestra la especificidad de los fenotipos de MKS1 supresión. La hibridación in situ de embriones en la etapa 11-somite (± 1 somite) teñidas con Krox20, pax2 y ribosondas MyoD (B, C ). Fenotipos se cuantificaron mediante mediciones de la primera a la última somite apreciable de cada embrión (flechas), cuantificado en c. Figura adaptada con autorización de 15. Figura 3. Ejemplos de modelos en vivo de dismorfología humana. (A) Dismorfología craneofacial. MRNA de control inyectado embriones (izquierda) y el embrión inyectado mutante (derecha) teñidas con azul alcián a 5 dpf. Mutantes embriones inyectados con mRNA muestran cabezas sobre todo pequeñas y deformes con una desorganización general del esqueleto craneofacial cartilaginoso incluyendo extendidas arcos branquiales y faltantes o estructuras malformadas. (B) Micro / macrocefalia. Control no inyectado embriones (izquierda) y kctd13 embrión MO-inyectado (a la derecha) a 5 dpf. Morphants muestran ensanchamiento de la cabeza, como se ve por el espacio entre los ojos. 21 (c) la integridad vascular reducida. Control no inyectado embriones (arriba) y eng embrión MO-inyectado (abajo) fotografiada usando microscopía de fluorescencia a 2 dpf en un fli1: reportero línea transgénica eGFP. Morphants muestran deterioro crecimiento de vasos intersegmentales y otras estructuras vasculares. 41 (d) de bucle corazón alterado. Hibridación in situ de la uniembriones de tipo salvaje njected (izquierda) muestran una expresión spaw en el mesodermo de la placa lateral izquierdo, mientras que ccdc39 morphant embriones mostraron bilateral (derecha) o, en la mayoría de los casos, la expresión spaw indetectable (no se muestra). 43 (e) Los quistes renales. Embrión WT no inyectado (arriba) y ift80 morphant (abajo). Morphants muestran grandes quistes renales (flecha), edema pericárdico (punta de flecha) y una cola rizada. 44 (f) Reducción de la filtración glomerular. Visualización fluorescente de un embrión de control inyectado (parte superior) y ift80 morphant (parte inferior) 24 h después de la inyección de la rodamina dextrano en el corazón. Se dispersa de fluorescencia en todo el sistema vascular y es casi completamente evacuados por el riñón como se ve la ausencia completa de la fluorescencia en el control. El morphant muestra persistente dextrano fluorescente, lo que sugiere una caída del filtrado glomerular. 46 (g) Distrofia Muscular. WT DNAJB6 mRNA embriones inyectados (arriba) muestran fibras musculares lentas normales que abarcan los somitas normalmente entre myosepta adyacente como se determina por inmunotinción con anticuerpos anti-miosina lenta. Mutant DNAJBb (abajo) muestra parcial a completa separación de fibras musculares de myosepta en uno o varios somitas. 19 (h) Ángulo de somitas. Magnified vistas laterales en vivo del control no inyectado (arriba) o kif7 morphants (abajo) fotografiados en 30 HPF. Morphants muestran somitas forma anormal, atribuibles al embarazo ectópico señalización de Hedgehog en el pez cebra miotoma 47. Todas las cifras adaptadas con permiso.