Danio rerio를 사용하여 병적 인 인간 게놈의 생체 모델링에
Summary
여기, 우리는 개발을위한 체계적인 접근 방법을 제시 생리 학적 관련성이 민감하고 특정<em> 생체 내</em> 인간의 병리에 변화를 해석하기위한 분석. WT와 돌연변이 인간의 mRNA와 모르 (MO) 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 microinjection을 통해 과도 유전자 조작 인간 발달 장애의 맥락에서 독점적으로 신속하게 분석 병원성 특히 돌연변이, 그러나에 개발 제브라 피쉬 배아의 온순함을 활용.
Abstract
여기, 우리는 제브라 피쉬 생체 보완에 사용 잠재적으로 임상 적으로 유의 한 nonsynonymous 변화를 쿼리 분석의 발달을위한 방법을 제시한다. 제브라 피쉬 (Danio rerio)는 자신의 실험 온순함으로 인해 유용한 동물 시스템입니다, 배아, 손쉬운 시청을 가능하게 급속한 발전 전직 생체를 받아야하는 투명하고, 유전자 조작 할 수있는 이러한 측면 배아의 분석에 상당한 발전을 위해 사용할 수있다 1. 분자 프로세스 및 형태 발생 신호. 함께 촬영이 척추 모델의 장점은 소아 질병 발달 결함을 모델링 제브라 피쉬는 매우 순종하고, 어떤 경우에는, 성인 발병 질환. 제브라 피쉬의 게놈이 높은 사람 (orthologous ~ 70 %)의에 보존되어 있기 때문에, 제브라 피쉬에서 인간의 질병 상태를 요점을 되풀이 할 수 있습니다. 이 돌연변이 인간 m의 주입을 통해 하나를 수행합니다음의 지배 또는 함수 대립 유전자의 증가, 또는 함수 변형의 손실을 모방하는 유전자를 억제하는 모르 (MO) 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 활용을 유도하는 RNA. 출장 인간의 mRNA와 MO에 의한 표현형의 보완을 통해, 우리의 접근 방식은 측정, 생리학 관련 표현형을 구출하는 돌연변이 발현의 능력에 따라 인간의 단백질 서열에 돌연변이의 해로운 효과의 해석을 할 수 있습니다. 인간의 질병 대립 유전자의 모델링 MO 및 / 또는 1-4 세포 단계에서 인간의 mRNA 및 7 일 게시물 수정 (DPF)까지 표현형을 가진 제브라 피쉬 배아의 microinjection을 통해 발생합니다. 다음과 같은 프로토콜에 설명 된대로이 일반적인 전략은 질병 표현형의 넓은 범위로 확장 할 수 있습니다. 우리는 형태 발생 신호, 두개 안면, 심장, 혈관 무결성, 신장 기능, 골격근 장애 표현형뿐만 아니라, 다른 사람에 대한 우리의 설립 모델을 제시한다.
Introduction
유전자형을 예측 임상 적 가치의 유전 정보와 할당 기능 해석은 의료 유전학의 주요 문제를 나타내며 게놈지도의 가속 기술 및 경제적 타당성과 함께 점점 더 신랄한되고있다. 따라서 환자에서 검출 알 수없는 의미의 변형 (VUS)의 병원성을 테스트하기 위해 새로운 패러다임을 개발하고 실행하는 것이 필요하다. 이 분석은 다음 시간 및 비용 효율적인 정확해야하며, 항구 잠재적 인 임상 유틸리티로의 전환을 촉진 할 수 있습니다.
마우스가 전통적으로 인간의 질병 모델링 분야의 선택의 도구가되었습니다 동안, 제브라 피쉬는 과학적으로 경제적으로 유리한 대리로 부상하고있다. 마우스와는 달리, 제브라 피쉬의 생물학 개발 병리의 실시간 영상을 허용 배아의 광학적 인 명확성에 힘 입어 모든 발달 단계에 쉽게 적시 액세스 할 수 있습니다. <sup> 1 돌연변이 제브라 피쉬 라인의 비교적 최근에 생성 기능 연구에 많은 고용 추가 테스트 및 모델링 옵션을 제공하고 있지만,이 기술은 (1,38에서 검토) 제한하고 있습니다. 뿐만 아니라 달성하기 힘든 특정 돌연변이의 노크 기능을 가진 유전자 돌연변이, 그들은 또한 단일 유전자 내 변이의 범위의 테스트를위한 중간 또는 높은 처리량 분석에 순종하지 않습니다. 중요한 시험의 하나의 제품군은 상속 모드를 알리고 중요한 세포 수준 (기능 대 기능의 게인 등 손실)에서 대립 유전자의 병원성 잠재력뿐만 아니라 정보를 제공하지만, 또한 효과의 방향 수 가족, 특히 작은 인간의 혈통은 유전자 전달의 형태에 제한된 정보를 항구. 사용 가능한 마우스 및 제브라 피쉬 모델의 사용의 추가 비교를 위해 표 1을 참조하십시오.
우리는 또한 참고다시 제브라 피쉬 모델 시스템에 내재 제한됩니다. 하지만 D. rerio는 장기 시스템의 신속한 초기 개발이, 성적 성숙은 약 3 개월이 필요합니다. 이 때문에 태아 및 소아 발병 질환이 과도 표현 모델에 가장 의무가 있습니다. 큰 화합물 화면을 수행하기위한 이상적인 반면, 유전자 돌연변이의 사용에 기여 nonsynonymous 변종의 수천의 체계적인 테스트 가능하지 않습니다, 그리고 소아 질환에 감지 할 계속합니다.
보완 테스트는 보존 개발 프로세스에 필요한 분자, 특히 때문에,이 실험 온순함, 동성의 높은 수준, 그리고 인간과 zebrafish의 단백질 간 기능의 보존을 활용 여기서 설명했다. 그림 1은 다양한 대립 유전자의 효과에 대한 테스트 및 확인 전략을 설명합니다. 두 기능의 손실 (LOF)과 지배적 인 분석을 수행 할 수 있습니다. LOF를 들어, 실험 모르의 최저와 관심의 유전자의 억제, 그리고 조사 대상 임상 표현형에 관련이있을 수 표현형에 대한 시금로 시작합니다. 또는 일반적으로 중 하나를 포함을 유도 결합 접합에 MO을 배치하여 접합을 방해하여, 억제 가까운 곳 제브라 피쉬의 현장 (tbMO 번역 차단제 모르)의 번역 시작 사이트 MO를 대상으로 번역을 차단하여도 달성 될 수있다 인트론 또는 탈선 엑손 (; sbMO 스플 라이스 차단 모르) 건너 뜁니다.
그 후, orthologous 인간의 성적에서 출장 발현이 도입되어 표현형의 정량화 할 수있는 구조를 측정한다. 분석이 설정되면, 인간의 메시지 후보자 돌연변이가 도입 WT 인간의 mRNA와 같은 효율 MO에 의한 표현형을 구출 할 수있는 능력을 분석 할 수 있습니다. 반대로, 후보 지배적 인 대립 유전자, 인간의 mRNA는 (하지만 MO) introduc입니다지배적 인 영향을 테스트 돌연변이의 도입은 인간의 임상 상태에서 관찰 것과 유사한 표현형을 유도합니다 반면 WT 인간의 mRNA는 조잡한, 제브라 피쉬의 해부학과 생리학에 영향을 미치지 않습니다 것을 기대와 ED. 이 실험은 지배적 인 영향 함수의 이득 (GOF) 또는 WT와 돌연변이 인간의 mRNA를 혼합하여 지배적 인 음성 메커니즘에 의해 발생하는지 해부 세밀한 추가 될 수 있으며, GOF 이벤트의 경우, WT 인간의 mRNA의 추가가 될 것으로 예상된다 무관, WT 및 돌연변이 mRNA를 혼합 지배적 인 음성 대립 유전자에 대한 반면 것은 돌연변이 메시지에 의한 표현형의 심각도를 변경해야합니다. 모든 경우에, 우리는 것이 좋습니다 주사의 모든 조합 (MO는 돌연변이 인간의 발현 등을 가진 모르 대 WT 인간의 mRNA를 바람직하게 태아의 동일한 클러치 (그림 1 참조) 내에서 수행 할 다음과 같은 해석은 다음과 같습니다.
LOF 시험을위한 :
- 만약 최저돌연변이 WT 발현에 의해 동등하게 구출 할 수있는 표현형을 생산 대립 가능성이 양성이다.
- 최저 표현형의 변이 구조는 최저 표현형 자체에서 구별 할 경우, 대립 유전자는 가능성 기능 null입니다. 실험 사실 널 (기능적 단백질)와 어떤 구조 능력이없는 초저 단백질의 활동 수준을 구별 할 수 없습니다.
- 최저 표현형의 변이 구조가 통계적으로 MO보다 더 있지만, WT보다 더 경우이 결과는 함수의 부분적인 손실을 보여줍니다로 대립 가능성이 hypomorph입니다.
지배적 테스트 :
- 거기 최저 표현형은 없지만, WT의 mRNA 주입 표현형을 생성하는 경우 실험 (아래) 진행하는 경우, 비상 계획을 사용해야합니다.
- WT의 mRNA에는 최저 표현형 및 사출이없는 경우에는 표현형을 생성하지 않습니다, 실험은 평소대로 진행됩니다.
- 만약 주입돌연변이 mRNA의 야생 타입의 mRNA의 그것과 동일하다의, 대립 유전자는 양성이나 기능의 손실이 될 수도 있고, 분석에 실패했을 수 있습니다. 이 추가 실험이 옵션을 구별해야합니다.
- 돌연변이 mRNA를 주입 미주리 최저 구별 경우 유전자 산물의 기능을 가능성이 어떤 방법으로 변경됩니다. 기능의 변화를 식별하는 야생 형 발현과 돌연변이 체의 mRNA의 적정을 실시하여야한다.
- 이 적정의 결과 만 야생형의 mRNA를 구별 할 경우, 그 효과는 적정 금액으로 변화되는 돌연변이 단백질 제품은 기질로 야생 유형 단백질을 사용하는 것으로 나타났습니다. 이 지배적 인 부정적인 표현형을 나타냅니다.
- 이 적정의 결과 혼자 돌연변이 mRNA의에 구별 할 수 있다면, 그것은 돌연변이 단백질 제품은 더 이상 야생 형과 같은 기능이없는 것으로 나타났습니다, 따라서 야생형 단백질 제품 사전의 양에 의해 영향을받지 않습니다전송. 이 대립 유전자 기능의 가능성이 이득인지 보여줍니다.
비상 계획 :
- 어떤 표현형 미주리 최저에서 제공하지 않지만 WT 발현에 존재하지 않으면 우리는 이러한 상황이 좋지 않은 것을 강조하지만, 추가 실험이 발생할 수 있습니다. WT 인간의 mRNA는 표현형을 최소화하기 위해 적정해야하며, 또한 새로운 세트 포인트로 사용할 수 있습니다. WT와 돌연변이 인간의 mRNA의 추가 coinjection는 돌연변이의 구출 능력에 따라 평가 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
방법은 인간의 유전 질환의 표현형 (표 2, 그림 3) 다양한 관련 nonsynonymous 변화의 분석에 적용 할 일반적인 프로토콜을 나타냅니다 여기에 설명. 우리의 접근 방식은 질병의 표현형에 변화의 잠재적 인 영향을 평가하는 것이 유용 입증하고, 질병 메커니즘을 (예 : Bardet-Biedl 증후군에 지배적 인 부정적인 돌연변이의 기여, 주로 상 염색체 열성 질환 17)를 해부하는 데 도움이. 현재까지 제시된 의사 결정 트리의 개발을 통해, 우리는 1000 대립 유전자의 과잉을, 인과 유전 질환과 관련된 200 개 유전자를 초과 합리적인 비용과 시간에 모델링했다.
여기서 자세히 설명하지 않지만, 우리는 이러한 방법을 통해 복사 번호 변종 (CNVs를)뿐만 아니라 유전 적 상호 작용으로 유전 병변의 다른 유형을 모델링하기에 적합한 것으로 나타났습니다. 이러한 이벤트의 분석의 범위를 벗어본 발명의 방법의 설명, 그들은 근본적으로 임상 적절한 표현형을 유도하거나 악화를 결정하는 후보 유전자 (동시에 주입 유전자의 쌍을 포함)의 체계적인 테스트의 동일한 원리에 의존하지만. 예를 들어, 16p11.2 CNV의 29 유전자의 한을 해명하는 것은 주입 머리를 한 세그먼트 내에서 29 유전자 각각에 해당하는 관찰 660킬로바이트 게놈 세그먼트의 중복을 가진 환자에서 관찰 소두증, mRNA가 관련이있을 수 있습니다 크기 측정 한 성적 증명서, KCTD13의 큰 기여를 공개, 2 DPF 5 DPF에서 실시 하였다. (21)는 또한, 우리는 Bardet-Biedl 증후군과 히 르츠 프룽 질병 모두 환자의 게놈 병변의 분석 유전 적 상호 작용 모델을 사용하고 있습니다. 22 개별적으로 동시에 두 개의 임상 정체성의 원인 유전자의 MO 억제를 비교함으로써, 우리는 베이로 결과 표현형을 식별 할 수 있었다NG 시너지 상호 작용보다는 단순히 첨가제 정도.
높은 감도 (98 %)와 ciliopathies 17에 기여 변형에 대한 특이성 (> 82 %)를 설립하는 데에도 불구하고, 우리는 아직 이러한 제브라 피쉬 모델에서 모든 표현형의 판독에 일반화 있는지 확인하기에 충분한 데이터가 없습니다. 이렇게하려면, 대립 유전자의 큰 숫자는 각각의 표현형 카테고리에서 테스트해야하며, 유전자 양성 또는 병원성이 될 것으로 예상. 이 임상에서 이러한 분석의 구현에 특히 중요합니다, VUSs의 기능 해석을 상기하면 진단 거짓 긍정과 거짓 부정의 강력한 이해 의사와 환자에게 이러한 결과의 전달을 동반 할 수있는 경우에만 관리를 알릴 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 방법은 인간의 유전 질환의 풍경의 더 나은 이해를 향해 크게 기여할 수있다. 우리는 이러한 모델은 foun의 역할을 할 것으로 예상임상 유전 정보의 향상된 해석 기초는 정확한하지만, 또한 치료 화면을 수행하는 것이 유용 모델로 채택 될 것입니다. 생체 데이터 또한 PolyPhen 23와 같은 소스에서 silico의 계산 예측에 비교 될 수있다, 24 체로, SNP에 & GO 25, 또는 26 MutPred 일치를 표시합니다. 예측 데이터베이스 SNPs를 & GO와 MutPred의 이전 연구에서 각각 정확도는 0.82과 0.81에 도달과 함께, 가장 정확한 것으로 밝혀졌다 있습니다. 27
우리는 소아 해부학 적 결함 (표 2, 그림 3)의 하위 집합에 대해 이러한 방법의 견고성을 설명하고 있지만, 특정 표현형이 방법으로 덜 다루기 쉬운 수 있습니다. 몇 가지 예외에도 불구하고, 우리의 프로토콜에 대한 의무가없는 질환의 세 가지 주요 클래스가 있습니다. 성인 발병 질환 (파킨슨 병 등) 배아 시스템의 모델에 도전을 나타냅니다. 음식물을 천천히ression 퇴행성 표현형 (예 : 측두엽 치매 등) 표현형을 생산하는 MO 활동의 일곱 DPF 창보다 더 많은 시간이 필요할 수 있습니다. 이러한 RNAi의 siRNA를 같은 다른 유전자 때려 눕힘 기술을 방해하거나 유전자 표적을 저하 할 수 있지만, 그것은 또한 이렇게 기간을 제한 없음으로, 특정 안정, 비 독성, 또는 MO를 28로 오래 지속되지 않습니다 것으로 나타났습니다 표현형합니다. 셋째, 같은 포유류의 폐와 같은 일부 척추 구조, 제브라 피쉬 배아에 충분히 orthologous 구조를 가지고 있지 않습니다. 우리는이 독특하고 바람직하지 않은 상황주의하지만 우리는 또한 WT 인간의 mRNA의 주입 표현형에 이르게하는 그 사건의 조사를 위해 제안 된 비상 계획을 제공하고 있습니다.
특정 질병 표현형는 추상화와 대리모의 큰 학위를 요구할 수 있습니다. 그것은 유전자의 기능을 충분히 모델과 TR 사이의 표현형 유사성을 약화 분화했다고 할 수 있습니다단말 표현형, 또는 그 제브라 피쉬의 생리는 본질적으로 인한 질병의 효과를 복잡. 이러한 경우에, 우리는 해고 이전에 생성 된 표현형의 추가 절개를하는 것이 좋습니다. 우리는이 분석에 대한 문제 표현형은 제브라 피쉬 배아에서 모델링 된 수있는 몇 가지 성공 사례를 생산했다. 예를 들어, TCF8에 돌연변이가 푹스 각막 이영양증 (FCD)과 관련된 유전자는 초기 개발이 증명서의 알려진 역할에 따라 대리 표현형 판독으로 낭배 형성의 결함을 사용하여 우리의 프로토콜을 사용하여 assayed되었다. 다른 인스턴스에서 29 예는 DNAJB6의 돌연변이에 의해 발생하는 성인 발병 근육 퇴행 위축, 우리는 인간의 삶의 첫 3-4 년에 병리 감지 근육을 잃은 있다는 사실에도 불구하고 5dpf 배아 근섬유의 표현형을 생성 할 수 있었다. 19
여기에 제시된 과도 돌연변이 모델뿐만 아니라, 다른 사람도 ADVANTA을 촬영했습니다신체 시스템의 다양한 인간 질병 모델이 과도 시스템의 GE. 하나의 예에서는, 색소 성 망막염은 망막 세포의 죽음의 결과로, 유전자 RP2의 최저로 제브라 피쉬에서 모델링 및 망막 박판 감소 하였다. 다섯 개의 돌연변이 체의 mRNA 중 4 명 구출에 실패하는 동안 인간의 야생형의 mRNA와 구조는 망막 박판의 세 층의 개발 결과. 30 인간의 감각 장애의이 모델은 형태 학적 표현형을 기반으로하지만, 그것은 또한 가능합니다 이러한 음향 놀라게하거나 억제를 전 진동 등의 자극에 대한 분석 응답. 47
최근 제브라 피쉬 모델이 아밀로이드 전구체 단백질을 통해 알츠하이머 질환 발병을 조사하기 위해 사용되었다. 31 저자는 유전자 녹다운 인간의 mRNA와 구출 할 수 모터 신경의 손상 축삭 가지가 발생했다. 마우스 모델은 미묘한 phenot 표시로이 모델은 특히 유익한 것으로 입증되었습니다ypes (단일 최저) 또는 출생 치사 (더블 최저). 개발을 통해 생체 내에서 zebrafish의 배아를 평가하는 능력은 감소 아밀로이드 전구체 단백질뿐만 아니라, 단백질의 적절한 기능에 대한 세포 및 세포 내 도메인을 모두 필요로하는 제공하는 직접적인 증거의 병원성 효과를 식별하는 데 도움이. 다른 주목할만한 모델이 포함 추가 근육 이영양증 32, 다이아몬드 Blackfan 빈혈 33, Axenfeld-Reiger 증후군 (안구 및 두개 안면 개발) 34, 염증성 장 질환 35 (항균 작용), 파킨슨 병 36 (신경과 운동 손실) 및 발작 37의 (수두증 및 과다).
보다 일반적인은 인간의 질병 표현형을 요점을 되풀이하는 것도 보여왔다 돌연변이 제브라 피쉬의 라인입니다. 1.38에 리뷰 모델은 백혈병, 흑색 종, 넓혀진 심근증, Duchenne 근육 퇴행 위축을 포함그리고 다른 많은.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 듀크 대학 학장의 여름 연구 원정대 (), 미국 심장 협회 (AHA) 교제 11POST7160006 (CG), 국립 보건원 (NIH)의 국립 안과 연구소 (EED), R01HD04260에서 보조금 R01-EY021872에서 지원을 인정 국가 아동 건강 개발 연구소 (NK), 당뇨병 소화기 및 신장 질환의 국립 연구소 (NK)에서 R01DK072301 및 R01DK075972, 그리고 유럽 연합 (GA NR에서 EU 제 7 회 FP의 재정 241955, 프로젝트 SYSCILIA;. EED, NK) NK는 고유 장 조지 W. Brumley 교수.
Materials
| Reagent | |||
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S, M0530L | |
| DpnI restriction endonuclease | NEB | R0176L, R0176S | |
| Max Efficiency DH5α competent cells | Invitrogen | 18258-012 | |
| Big Dye Terminator | Applied Biosystems | 4337455 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Invitrogen | AM1340, AM1344, AM1348 | |
| Morpholino | Gene-Tools | n/a | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | Prepare as 0.003% PTU in embryo media |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4% |
| Tricaine methane sulfonate | Western Chemical | N/A | For anesthetization and euthanasia |
| Equipment | |||
| PTC-225 Tetrad Thermal Cycler | BioRad | Any equivalent thermal cycler | |
| Nano Drop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| SMZ 745T Stereomicroscope | Nikon | ||
| AZ100 Stereomicroscope | Nikon | ||
| DS Fi1 Digital Camera | Nikon | For color/fluorescent imaging | |
| DS QiMC Digital Camera | Nikon | For black/white imaging | |
| Advanced Resarch 3.2 Imaging Software | NIS- Elements |
References
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