Summary

Isolamento de fluido cerebrospinal de embriões de roedores para uso com dissecados Cerebral Cortical Explantes

Published: March 11, 2013
doi:

Summary

O ventricular líquido cefalorraquidiano (LCR) banha os neuroepiteliais e cerebral células progenitoras corticais durante o desenvolvimento do cérebro no início do embrião. Aqui descrevemos o método desenvolvido para isolar CSF ventricular de embriões de roedores de idades diferentes, a fim de investigar a sua função biológica. Além disso, podemos demonstrar o nosso dissecção explante cerebral cortical e técnica de cultura que permite o crescimento de explantes com volumes mínimos de meio de cultura ou do LCR.

Abstract

A CSF é um fluido complexo, com uma proteoma dinamicamente variáveis ​​ao longo do desenvolvimento e na idade adulta. Durante o desenvolvimento embrionário, a CSF nascente diferencia do líquido amniótico no fechamento do tubo neural anterior. Volume de LCR, então aumenta ao longo do dia subsequentes como as células progenitoras gliais que revestem os ventrículos e plexo coróide gerar CSF. Os contactos embrionárias CSF a superfície apical ventricular, das células estaminais neurais do cérebro e da medula espinal em desenvolvimento. CSF fornece pressão de fluido crucial para a expansão do cérebro em desenvolvimento e distribui crescimento importante promover factores de células progenitoras neurais de uma forma temporal específico. Para investigar a função do LCR, é importante isolar amostras puras de CSF embrionário sem contaminação a partir do sangue ou do tecido em desenvolvimento telencefálica. Aqui, nós descrevemos uma técnica para isolar amostras relativamente puras de ventricular embrionário CSF ​​que podem ser usados ​​parauma vasta gama de ensaios experimentais, incluindo a espectrometria de massa, electroforese de proteínas, e de células e cultura de explantes primários. Demonstramos como dissecar e cultura explantes corticais em membranas porosas de policarbonato para crescer desenvolvimento do tecido cortical com volumes reduzidos de mídia ou CSF. Com este método, as experiências podem ser realizadas utilizando CSF ​​a partir de diferentes idades ou condições para investigar a actividade biológica do proteoma CSF nas células-alvo.

Introduction

A CSF é um fluido complexo que banha o neuroepitélio desenvolvimento 1-6 e fornece 7 pressão essenciais e promover o crescimento pistas para o cérebro em desenvolvimento 8-12. Para o estudo da CSF ao longo do desenvolvimento do cérebro, desenvolvemos técnicas para isolar CSF ventricular de desenvolvimento de embriões de rato ou mouse durante vários estágios de desenvolvimento 6,9. Os métodos anteriores de isolamento incluiu o uso de um vidro de micro-agulha e isolando o CSF utilizando um micro-injector 1,2. O nosso método utiliza uma pipeta de vidro de micro-capilar, cuja ponta foi puxado para criar um ponto de penetração do tecido ultrafinas melhorada. A pipeta de vidro de micro-capilar é ligado a um aspirador, de modo que recolha CSF ventricular pode ser controlada com mudanças suaves de pressão. Para investigar a influência de células-tronco de sinais LCR, dissecamos cerebrais corticais explantes, colocá-los em membranas de policarbonato, e flutuar-los no cu apropriadasLTURE meio suplementado com 9 amostras de LCR. Com esta técnica, uma redução dos volumes de meios de cultura são suficientes para o tecido, o que permite um uso eficiente da CSF 9.

Protocol

1. Isolamento embrião / Preparação Esta técnica pode ser usada para ratinho ou rato. Neste protocolo que demonstram a técnica de coleta de LCR e dissecção explante cortical cerebral com o cérebro de rato embrionário. Vamos comentar sobre eventuais diferenças importantes para ratos contra ratos que existem dentro das técnicas gerais. Para o sistema de teste idade embrionária, E1 é classificado como o dia da ficha para ratos, E0.5 e é classificado como o dia da ficha para os ratos….

Representative Results

A coleção CSF ​​deve produzir um líquido claro e transparente. Não deve haver qualquer evidência de contaminação do sangue, como foi demonstrado por um fluido tingido vermelho ou amarelo no aspirado e no tubo de Eppendorf. Também deve haver nenhuma evidência de tecido aspirado e no tubo de Eppendorf. Quando o CSF ​​é centrifugado, pode-se igualmente avaliar a CSF microscopicamente para assegurar que não existe contaminação. Se houver sinais de contaminação, o QCA deve ser descartada. De uma ninhad…

Discussion

O método descrito para a recolha ventricular CSF produziu amostras relativamente puras de CSF embrionário com composição e actividade da proteína estável consistente em uma série de ensaios celulares 9. Com uma técnica boa coleção e tamanho de leitegada de 10 E14.5 ratos, pode-se esperar para coletar 10-15 ul da CSF, e de uma ninhada de ratos E16, pode-se esperar para coletar cerca de 50-90 ul da CSF. Esta técnica minimiza a contaminação a partir de recolha de sangue e de tecidos, por meio de obs…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Estamos gratos pelo apoio do NIH (números Prêmio R00 NS072192 para MKL, HD029178 para AS.L., e 2 RO1 NS032457 para CAW). MKL é o destinatário de Boston das Crianças Carreira de Desenvolvimento da Irmandade Hospital / Harvard Medical Fellowship Shore School e membro da Fundação Alfred P. Sloan. CAW é um investigador do Instituto Médico Howard Hughes.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Wiretrop II capillary needles Drummond Scientific #5-000-2020
Sylgard Ellsworth Adhesives #184 SIL ELAST kit
Aspirator tube assembly Sigma #A5177-5EA
Disposable filter Venturi or local pharmacy not available Standard cigarette filter
Roundstock opthalmic knife (15 degree stab knife) World Precision Instruments, Inc. #500250
35mm glass bottomed culture dish MatTek Corp. #P35G-1.5-14-C
Platinum-iridium wire Tritech Research #PT-9010-010-3FT
Nuclepore Track-Etch Membrane Whatman #09-300-57
Hanks Balanced Salt Solution Fisher Scientific #SH30031.FS
Iridectomy Scissors Fine Science Tools #15000-02

References

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Citer Cet Article
Zappaterra, M. W., LaMantia, A. S., Walsh, C. A., Lehtinen, M. K. Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants. J. Vis. Exp. (73), e50333, doi:10.3791/50333 (2013).

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