Ett<em> In vitro</em> Modell för att studera skillnader mellan de mänskliga makrofagdifferentiering och polarisation
Summary
Monocythärledda makrofager är viktiga celler av det medfödda immunförsvaret. Här beskriver vi en lättanvänd<em> In vitro</em> Modell för att generera dessa celler. Använda gradient centrifugering, negativ pärla isolering och specifik cell odlingsbetingelser, kan monocythärledda makrofager genereras för fenotypiska och funktionella studier.
Abstract
Monocythärledda makrofager är en viktig celltyp av det medfödda immunförsvaret. Musmodeller studerar makrofag biologi lider fenotypiska och funktionella skillnader mellan murina och humana monocythärledda makrofager. Därför beskriver vi här en in vitro-modell för att skapa och studera primära humana makrofager. Kortfattat, efter densitetsgradientcentrifugering av perifert blod från en underarm ven är monocyter isolerade från perifert blod mononukleära celler med användning av negativ magnetisk pärla isolering. Dessa monocyter odlas sedan i sex dagar under specifika förhållanden för att framkalla olika typer av makrofagdifferentiering eller polarisation. Modellen är enkel att använda och kringgår de problem som orsakas av artspecifika skillnader mellan mus och människa. Vidare är den närmare den in vivo-betingelser än användningen av odödliggjorda cellinjer. Sammanfattningsvis är den modell som beskrivs här lämpar sig för att studera macrophage biologi, identifiera sjukdomsmekanismer och nya terapeutiska mål. Även om inte helt ersätta experiment med djur eller mänskliga vävnader erhållna obduktion, låter den modell som beskrivs här identifiering och validering av sjukdomsmekanismer och terapeutiska mål som kan vara mycket relevant för olika mänskliga sjukdomar.
Introduction
Monocythärledda makrofager är en viktig cellulär del av det medfödda immunförsvaret och bidra till många akuta eller kroniska inflammatoriska processer 1. Makrofager spelar en viktig roll i många inflammatoriska sjukdomar som ateroskleros eller cancer 2. Makrofager visar en hög grad av plasticitet och kan anta olika fenotyper beroende på lokala micromilieu 3. Således, studera makrofagdifferentiering och heterogenitet är viktigt för att öka vår kunskap om patofysiologin vid många sjukdomar och för att möjliggöra identifiering av nya terapeutiska mål och utveckling av nya behandlingsmetoder.
I många fall används murina modeller användes för att undersöka patofysiologin av specifika sjukdomar. Men studerar makrofag biologi med musmodeller tillsammans med flera brister: (1) Andelen leukocyt delmängd tal (dvs. monocyter och granulocyter) i peripheral blod av möss eller människor skiljer sig avsevärt föreslå olika roller monocyter i murina och humana patofysiologi. (2) Det finns stora skillnader i genuttryck mellan murina och humana perifera blodmonocyter tyder betydande skillnader i deras funktion under hälsa och sjukdom 4. (3) Ett antal markörer som används för att identifiera murina monocyter och makrofager (F4/80, LYC, osv.) Inte existerar i mänskliga myeloidceller, gör överföringen av resultaten i musmodeller för mänskliga situationen ganska svårt.
Således, för att öka vår förståelse av makrofag differentiering och heterogenitet i mänsklig sjukdom, måste vi använda modeller som arbetar med mänskliga makrofager. Därför beskriver vi här en modell av human primär makrofag generation som är enkel att använda och möjliggör studiet av mänskliga monocythärledda makrofager in vitro under olika tillstånd som leder till olika makrofag posation typer. I flera studier har vi använt den in vitro-modell av monocythärledda primära humana makrofager att analysera makrofag biologi och dess potentiella betydelse för människors ateroskleros 5-7.
Även om inte helt ersätta experiment med djur eller mänskliga vävnader erhållna obduktion, låter den modell som beskrivs här identifiering och validering av sjukdomsmekanismer och terapeutiska mål som kan vara mycket relevant för olika mänskliga sjukdomar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Monocythärledda makrofager utgör det avgörande celltypen av det medfödda immunförsvaret. De spelar en viktig roll i många inflammatoriska sjukdomar innefattande ateroskleros eller cancer 2. Således, studera makrofag biologi är viktigt för att öka vår kunskap om patofysiologin vid många sjukdomar och för att möjliggöra utveckling av nya behandlingsmetoder.
Många studier tillämpas av musmodeller överuttryck eller saknar vissa gener av intresse. I fallet med monocyt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Nadine Wambsganss för utmärkt tekniskt bistånd. Detta arbete stöddes av ett bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1) och delvis genom bidrag från Innovation Fund gräns (University of Heidelberg) till CAG
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml centrifuge tube (sterile) | Fisher | 055398 | |
| D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 14190-250 | |
| EDTA | Sigma | T9285 | |
| BSA | Sigma | A-8806 | |
| FCS | Invitrogen | ||
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| FACS tubes | Fisher | 352008 | |
| Macrophage-SFM (1X) | Invitrogen | 12065-074 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | |
| human M-CSF 10 μg | Peprotech | 300-25 | |
| Cell Culture Plates 6-well | Fisher | 07-200-80 |
References
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Gordon, S., Mantovani, A. Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes. European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).
- Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
- Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).
- Gleissner, C. A., et al. CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages. Circ. Res. , (2009).
- Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages. J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).
- Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
- Verreck, F. A. W., et al. Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
- Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. PLoS One. 7, e42656 (2012).
- Boyle, J. J., et al. Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype. American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).
- Cho, H. J., et al. Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation. Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).
- Vogt, G., Nathan, C. In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).
- Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus. Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).
- Qin, Z. Y. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5, e8668 (2010).
- Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Martín-Fuentes, P., et al. Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response. The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).
