Investigação de polarização de macrófagos Usando medula macrófagos derivados
Summary
O artigo descreve a adaptação prontamente fácil<em> In vitro</em> Modelo para investigar a polarização de macrófagos. Na presença de GM-CSF/M-CSF, as células estaminais / progenitoras hematopoiéticas da medula óssea são dirigidos para diferenciação monocítica, seguido por estimulação M1 ou M2. O status de ativação pode ser rastreado por mudanças em antígenos de superfície celular, expressão gênica e de vias de sinalização celular.
Abstract
O artigo descreve um prontamente adaptável fácil modelo in vitro para investigar a polarização de macrófagos. Na presença de GM-CSF/M-CSF, as células estaminais / progenitoras hematopoiéticas da medula óssea são dirigidos para diferenciação monocítica, seguido por estimulação M1 ou M2. O status de ativação pode ser rastreado por mudanças em antígenos de superfície celular, expressão gênica e de vias de sinalização celular.
Introduction
Distinta de respostas inflamatórias clássicos, macrófagos que infiltram os tecidos muitas vezes exibir o status de ativação polarizada que desempenha um papel crucial na regulação das funções fisiológicas do tecido hospedeiro 1-8. Após a estimulação, a ativação dos macrófagos podem ser classificados em clássico (M1) e alternativos (M2) a ativação 2, 4, 9. M1 activação macrófago depende receptores do tipo Toll (TLR) e a activação do factor nuclear kappa B (NFkB) / c-Jun N-terminal quinase 1 (JNK1), levando à produção de citoquinas inflamatórias, tais como TNF-e IL-α 1β e activação da iNOS, que resulta num aumento da produção de espécies de oxigénio reactivas, como o óxido de nitreto de (NO), 10, 11. Em contraste, os macrófagos M2 recrutas activação de PPARy, PPARô, ou IL-4-STAT6 caminhos, conduzindo a, anti-inflamatórios activação alternativa (M2), que está associado com a sobre-regulação do receptor de manose de CD206, e arginase 1 (Arg1) 6, 12 – 14 </ Sup>.
Macrófagos derivados de medula óssea (BMDM) apresentam um ideal modelo in vitro para entender os mecanismos que controlam a polarização de macrófagos ativados 15. Especificamente, a activação de macrófagos M1 pode ser induzida por lipopolissacáridos (LPS) de estimulação, enquanto M2 polarização de macrófagos pode ser induzida por IL-4 e / ou IL-13. Osso maduro macrófagos derivados da medula e macrófagos activados podem ser identificados através de análise de citometria de fluxo para a expressão de antigénios de superfície, incluindo CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 e CD86 9, 16, 17. Além disso, as alterações na produção de citoquinas e as vias de sinalização celulares associados com a polarização de macrófagos pode ser medida por RT-PCR quantitativo e Western blotting, respectivamente. Em resumo, rato macrófagos derivados de medula óssea pode servir como um modelo relevante para estudar a polarização de macrófagos in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrevemos aqui um processo simples e facilmente adaptável in vitro para induzir a activação dos macrófagos derivados de células progenitoras da medula óssea. Este procedimento pode ser utilizado para a investigação dos mecanismos responsáveis pela polarização dos macrófagos. A pureza dos macrófagos maduros obtidos utilizando este protocolo médias de 95-99%, e não há procedimentos de purificação adicionais são necessários. Para investigar a função de genes específicos de interesse …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela American Heart Association (BGIA 7.850.037 para Beiyan Dr. Zhou).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Thermo Scientific | SH30259.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Murine GM-CSF | PeproTech | 315-03 | |
| NH4Cl | StemCell Technologies | 7850 | |
| L-929 | ATCC | CCL-1 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 10 x PBS | Thermo Scientific | AP-9009-10 | |
| Anti-mouse CD11b-APC | eBioscience | 17-0112-81 | |
| Anti-mouse F4/80-FITC | eBioscience | 11-4801-81 | |
| Anti-mouse CD69-PE | eBioscience | 12-0691-81 | |
| Anti-mouse CD86-PE | eBioscience | 12-0862-81 | |
| Propidium Iodine | Invitrogen | P3566 |
References
- Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis. Circulation. , (2012).
- Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Tabas, I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).
- Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance. Nature. 447, 1116-1120 (2007).
- Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance. Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).
- Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation. Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).
- Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -. W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat. Med. 11, 191-198 (2005).
- Saberi, M., Woods, N. -. B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice. Cell Metab. 10, 419-429 (2009).
- Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -. H. Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).
- Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties. Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).
- Bronte, V., Zanovello, P. Regulation of immune responses by l-arginine metabolism. Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).
- Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation. Circulation. 125, 2892-2903 (2012).
- Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation. J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).
- Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation. J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).
- Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor. J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).
- Biswas, S. K., Mantovani, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm. Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).
